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如何利用配備二極管陣列檢測器的安捷倫高效液相色譜分析吐溫 80
閱讀：1487 發布時間：2020-12-14摘要：吐溫 80 通常用作藥物中的穩定劑，或用于組織處理的抗鈣化劑。吐溫 80 是不均勻混合物，且缺乏良好的發色團，定量分析具有挑戰性。本研究使用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 色譜柱和 Max Plot 二極管陣列檢測器 (DAD) 開發出一種簡單快速的安捷倫高效液相色譜 (HPLC) 分析方法，用于分析溶于 0.02 mol/L 磷酸鹽緩沖液中的吐溫 80?；谕聹?80 洗脫區域中色譜峰的峰面積總和進行定量測定。經方法學評估，其精度、準確度、線性和定量限/檢測限實驗均得到了可接受的結果。這種方法可用于對含吐溫 80 的各種水溶液進行質量控制和穩定性監測。
前言：吐溫 80 也稱為聚山梨酯 80，是一種常用的非離子表面活性劑、乳化劑、穩定劑和增溶劑，廣泛用于藥物、食品、化妝品、維生素、疫苗、靜脈制劑、洗劑和肥皂中。在蛋白質制劑中，吐溫 80 及其他聚山梨酯可大程度減小表面吸附，降低蛋白質變性的速率，并提高藥物的溶解性和穩定性。吐溫 80 也可用于心臟瓣膜組織制備中，戊二醛前、后組織處理（固定）的抗鈣化劑1 。鑒于這些關鍵作用，需要準確定量吐溫 80 以確保產品質量。吐溫 80 是脂肪酸（主要是油酸）偏酯與山梨糖醇及其酸酐乙氧基化（每摩爾山梨糖醇和山梨酸酐用 20 摩爾左右環氧乙烷進行乙氧基化）的混合物。圖 1 示出其分子結構。作為大分子化合物，由于混合物不均勻且缺乏紫外發色團，因此難以對聚山梨酯進行定量分析。文獻中描述了聚山梨酯 80 的幾種定量分析方法。已經報道了基于聚山梨酯 80 化學轉化的間接方法，如堿誘導水解成油酸2,3。這些方法費時費力，包括在 40 °C 至 60 °C 的高溫下消解 6 至 18 小時。也有將 HPLC 分離與不同檢測方法（如蒸發光散射檢測 (ELSD)4–6、電噴霧檢測 (CAD)7 和質譜 (MS)8 ）聯用，開發出幾種吐溫 80 的直接分析方法。一些研究人員試圖不分離并用單一色譜峰進行定量分析4,9。這些方法可能需要復雜的儀器，而且可能無法用于監測吐溫 80 溶液的穩定性。本研究介紹了一種用于測定水溶液中吐溫 80 的簡單快速的方法，該方法基于 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 色譜柱和二極管陣列檢測器進行反相 HPLC 分離。通過測試其專屬性、線性、精度、靈敏度和準確度來評估該方法用于測定磷酸鹽緩沖液中吐溫 80 的適用性。這種方法為科學家提供了一種理想選擇，因為二極管陣列檢測器比 ELSD、CAD 和 MS 檢測器更常用于 HPLC 分析。
實驗部分：材料和儀器吐溫 80 標準品購自 US Pharmacopeial Convention (Rockville, MD)。利用購自 Fisher Chemical (Fair Lawn, NJ) 的吐溫 80 配制吐溫 80 樣品。乙腈（HPLC 級）、磷酸二氫鈉二水合物（經認證的晶體）、磷酸氫二鈉二水合物（經認證的晶體）和磷酸 (> 85%) 購自 Fisher Chemical。水采用 Milli-Q 水純化系統 (Millipore, Bedford, MA) 制備得到。將 HPLC 系統與二極管陣列檢測器 (DAD) 聯用，對吐溫 80 樣品進行分析。利用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 ECC18, 3.0 × 100 mm, 2.7 µm 色譜柱（部件號 695975-302A，安捷倫科技公司，加利福尼亞州圣克拉拉）來洗脫吐溫 80 峰。將 DAD 分辨率設置為 1.2 nm，在 195–400 nm 的波長范圍內進行掃描。采集 Max Plot 信號進行定量分析。進樣量為 20 µL，使用等度流動相運行，其中包括流動相 A（0.1% 磷酸水溶液）和流動相 B（0.1% 磷酸乙腈溶液），A:B 的恒定比例為 20:80。在整個分析過程中，色譜柱保持為 30 °C，流動相流速保持為 0.4 mL/min。
結果與討論：分析的優化文獻推薦使用幾種 HPLC 色譜柱和流動相（如 HPLC C18 色譜柱）4 ，梯度開始時為 70:30 的水:甲醇，在 4 分鐘時改變為水: 甲醇 10:904 。吐溫 80 未獲得單個峰，也未*洗脫。使用 InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 色譜柱和 Max Plot 二極管陣列檢測器的上述當前條件，得到一種快速且相對簡單的方法來分析磷酸鹽緩沖液中吐溫 80 的濃度通過對每個時間點處測得的大光譜吸光度繪圖，得到 Max Plot 色譜圖。Max Plot 色譜圖使分析人員能夠看到樣品中的所有色譜峰，無論 λmax（大吸光度所對應的波長）是多少。圖 2 示出溶于 0.02 mol/L 磷酸鹽緩沖液中的 USP 吐溫 80 標樣的 Max Plot 色譜圖。吐溫 80 的弱紫外吸光度限制了通過固定單波長來分析吐溫 80。M. Klein 等人10 使用凝膠過濾色譜 (GFC) 柱和 UV 245 nm 條件分析吐溫 80。Klein 方法的靈敏度較差。當我們嘗試從 DAD 數據中提取 245 nm 處的色譜圖時，獲得了出人意料的色譜圖。圖 3 示出吐溫 80 樣品的 Max Plot 及其在 245 nm 處提取的色譜圖之間的比較。在 245 nm 處提取的色譜圖相比原始 Max Plot 色譜圖峰數量更少，并且 Max Plot 色譜圖中的所有峰在 245 nm 處表現出較弱的紫外吸光度。結果清楚地表明，Max Plot 二極管陣列檢測器更適合用于吐溫 80 分析。 Max Plot 色譜圖中的一個峰或一組峰能否用于吐溫 80 的定量分析？對由 USP 吐溫 80 標準品和 Fisher 吐溫 80 制得的濃度為 10 mg/mL 的吐溫 80 溶液的分析結果進行比較，它們的 Max Plot 色譜圖分別如圖 2 和圖 3A 所示。即使吐溫 80 的濃度相當（10.033 mg/mL USP 吐溫 80 和 10.145 mg/mL Fisher 吐溫 80），色譜圖在相似保留時間處仍表現出不同的峰強度。
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結論：本研究開發出一種簡單快速的 HPLC 分析方法，分析溶于 0.02 mol/L 磷酸鹽緩沖液中的吐溫 80，該方法使用 InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 色譜柱和 Max Plot 二極管陣列檢測器 (DAD)。該方法準確、精密而靈敏。如采用適當的樣品預處理，較寬的校準范圍可以使該方法應用于各種水溶液（如治療性蛋白質制劑）。此外，該方法可用于研究吐溫 80 溶液的穩定性。