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在線固相萃取非抑制離子色譜法測(cè)定嬰兒配方奶粉中的左旋肉堿
閱讀：783 發(fā)布時(shí)間：2019-5-30左旋肉堿（L-Carnitine, β-羥基γ-*銨丁酸）又稱(chēng)肉毒堿或維生素 BT，其化學(xué)式為C7H15O3N，分子量為162.2，是一種類(lèi)氨基酸。L-肉堿作為 載體將長(zhǎng)鏈脂肪酸從腺粒體膜外輸送到膜內(nèi)，促進(jìn)脂肪酸的β-氧化，從降低 血清膽固醇及甘油三脂的含量，提高機(jī)體耐受力及減少代謝毒性作用[i-iv]。對(duì) 嬰幼兒來(lái)說(shuō)，L-肉堿在維持嬰幼兒生命及許多促進(jìn)發(fā)育的生理過(guò)程，如生酮 作用、蛋白質(zhì)代謝等方面均有一定的功能[v,vi]。我國(guó)及許多其它國(guó)家已規(guī)定在 嬰幼兒食品配方中添加適量的L-肉堿，以滿(mǎn)足其生理需要，更好地促進(jìn)嬰幼 兒健康成長(zhǎng)[vii-x]。
左旋肉堿極性較強(qiáng)，缺少發(fā)色基團(tuán)，定量分析困難。國(guó)內(nèi)外對(duì)左旋肉堿 的測(cè)定主要有酶法[xi,xii]、電泳[xiii,xiv]、流動(dòng)相注射串聯(lián)質(zhì)譜法[xv]，液相色譜 法[xvi-xix]等。酶法專(zhuān)屬性強(qiáng)，但前處理繁瑣，液相色譜法中低波長(zhǎng)檢測(cè)則 干擾較多，衍生法靈敏度高，但前處理復(fù)雜，所用衍生劑毒性強(qiáng)。其它方法 有的靈敏度較低。有的設(shè)備較貴等原因較少使用。
離子色譜法可測(cè)定在水溶液中能電離的物質(zhì)。在酸性溶液中，左旋肉堿 表現(xiàn)為陽(yáng)離子特性，帶正電荷，可用陽(yáng)離子交換色譜柱分離。但左旋肉堿的 兩性特征使其在抑制后呈電中性，無(wú)法采用抑制型電導(dǎo)檢測(cè)。同時(shí)，奶粉中 左旋肉堿添加量較低，需要更低檢出限的測(cè)定方法。為此，我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)， 摸索出左旋肉堿的在線固相萃取非抑制型離子色譜測(cè)定的新方法。該方法前 處理簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速，用于奶粉樣品中左旋肉堿的檢測(cè)，結(jié)果令人滿(mǎn)意
測(cè)試條件
儀器：賽默飛戴安ICS系列離子色譜系統(tǒng)帶雙六通閥及雙泵。 分析柱: IonPac CS17 + IonPac CG17，4 mm 濃縮柱: IonPac TCC-UPL1 MSA：0-20 min，3 mM；流速：1 mL/min 柱溫：30 ℃
檢測(cè)方式：抑制型電導(dǎo)檢測(cè)
進(jìn)樣量：500 µL
樣品前處理
稱(chēng)取奶粉樣品約1 g至50 mL比色皿中，加入超純水 14 mL，適當(dāng)搖晃，使奶粉充分溶解后加入21 mL乙腈沉淀蛋白，靜置10 min，取上層清液，10000 r/min離心 10 min后，稀釋5倍，將稀釋液依次通過(guò)0.22 µm尼龍濾膜 和OnGuard II RP柱、Na柱，棄去6 mL初始流出液后采集 2 mL樣品用于離子色譜測(cè)定。 OnGuard II RP柱（規(guī)格2.5 cc），預(yù)先使用10 mL甲 醇和15 mL水活化。 OnGuard II Na柱，用10 mL水活化。
結(jié)果與討論
1. 前處理?xiàng)l件的選擇
奶粉配方比較復(fù)雜，含有大量蛋白質(zhì)、糖和鹽。如 果奶粉中的蛋白質(zhì)不經(jīng)去除而直接進(jìn)入色譜柱，則可能 吸附在色譜柱上，導(dǎo)致色譜柱柱效降低甚至失效。沉淀 蛋白質(zhì)的常用方法有重金屬鹽沉淀法、酸沉淀法、有機(jī) 溶劑沉淀法等。人為引入金屬鹽會(huì)導(dǎo)致去除成本升高， 去除不干凈可能導(dǎo)污染色譜柱而使色譜柱失效。如果采 用酸沉淀法，會(huì)引入大量氫離子，對(duì)左旋肉堿出峰產(chǎn)生 干擾。因此，這兩種方法在本試驗(yàn)中均不考慮。采用加 入乙腈沉淀蛋白的方法，沉淀蛋白效果較好，可得到 澄清的上層溶液。通過(guò)在1 g奶粉中加入1 mL、2 mL、 5 mL、10 mL、14 mL的高純水來(lái)溶解奶粉，發(fā)現(xiàn)如果加 入水的量過(guò)少，則奶粉溶解不充分，考慮到檢出限的限 制，我們用14 mL高純水來(lái)溶解1 g奶粉樣品。用乙腈來(lái)沉 淀蛋白，乙腈的量是需要考慮的重要因素。在14 mL的奶 粉樣品中加10 mL、14 mL、18 mL、21 mL、24 mL的乙 腈，發(fā)現(xiàn)如果乙腈的加入量小于水的量，則蛋白沉淀不 *，大量蛋白懸浮于溶液中，無(wú)法沉淀。隨乙腈加入 量加大，沉淀蛋白速度加快，上層液更加澄清。考慮成 本因素，終確定加入乙腈量為21 mL。即可使蛋白沉淀 *，又不至于溶液中有太高比例的乙腈，導(dǎo)致浪費(fèi)和 后續(xù)處理困難。 稀釋5倍的提取液依次通過(guò)RP柱和Na柱進(jìn)行凈 化。用RP柱可除去疏水性的脂肪等物質(zhì)，Na柱作為陽(yáng)離 子交換柱，可除去鉀、鈣等陽(yáng)離子，避免可能的干擾。
2. 閥切換條件的確定
進(jìn)樣后，將閥切換到濃縮柱一邊，用純水將樣品沖入 濃縮柱，這時(shí)，殘留的陽(yáng)離子及左旋肉堿濃縮在柱上，乙 腈被沖出。5分鐘后，乙腈被沖洗干凈。再將閥切換到分離 柱側(cè)，左旋肉堿在色譜柱上得到分離。比較了不同時(shí)間純 水的沖洗效果，5分鐘比較合適，可將乙腈及其它無(wú)保留雜 質(zhì)沖洗干凈。閥切換配置圖如圖1所示，切換程序見(jiàn)表1。
3. 色譜柱的選擇 因?yàn)槭欠且种齐妼?dǎo)檢測(cè)，所以為了降低噪音，需要 選擇低淋洗強(qiáng)度淋洗液就能洗脫的離子交換柱。在戴安 產(chǎn)品中符合要求的柱子有IonPac CS17、 IonPac CS18 （6.0 µm, 250 mm×2 mm）、IonPac SCS1三種不同色 譜柱。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，IonPac SCS1柱親水性差，左旋肉堿的 峰形不好。IonPac CS17、 IonPac CS18都是很低疏水性 的柱，左旋肉堿的峰形對(duì)稱(chēng)性好。但實(shí)際樣品測(cè)試的時(shí) 候，IonPac CS18柱上左旋肉堿被不明峰干擾。因此，選 擇CS17 + CG17作為分析L-左旋肉堿的色譜柱。
4. 淋洗液濃度的確定
依次選用6、5、4、3、2 mmol/L的甲基磺酸，測(cè)定 奶粉中左旋肉堿的色譜分析特征，確定合適的淋洗液濃 度。結(jié)果表明：隨淋洗濃度從6 mmol/L降低到2 mmol/ L，背景電導(dǎo)從2231 uS降低至777 uS，噪聲降低，理 論塔板數(shù)提高，各成分間的分離度增大，峰形改善，信 噪比從12增大至67.8，但保留時(shí)間也從6.91 min增大至 15.51 min。。綜合考慮，我們選擇3 mmol/L的甲基磺酸 作為分析用淋洗液。在優(yōu)化的淋洗液濃度下，標(biāo)準(zhǔn)樣品 及真實(shí)樣品的左旋肉堿色譜圖如圖2所示。
5. 干擾因素
通過(guò)在前處理時(shí)加入鈉柱，去除鎂、鈣、鉀、鐵、 銅、錳、鋅等陽(yáng)離子，避免干擾左旋肉堿。干擾電導(dǎo)響 應(yīng)的乙腈，也已經(jīng)在切換濃縮過(guò)程被純水沖出濃縮柱， 因此不會(huì)干擾左旋肉堿的檢測(cè)。
6. 檢出限與線性范圍
按實(shí)驗(yàn)方法在選定的色譜條件下，對(duì)左旋肉堿進(jìn)行 線性和檢出限測(cè)定。取標(biāo)準(zhǔn)工作液，以高純水稀釋成 0.05、0.1、0.2、0.5、0.8、1 mg/L，用離子色譜進(jìn)行 檢測(cè)，以峰面積y對(duì)質(zhì)量濃度x（mg/L）進(jìn)行作圖，得回 歸方程y=0.686x-0.006。線性范圍17.5 mg/Kg～175 mg/ Kg，相關(guān)系數(shù)r>0.9995。取標(biāo)準(zhǔn)工作液，以高純水稀釋 成0.01、0.02、0.03、0.04 mg/L，按優(yōu)化條件進(jìn)行處理 后，以信噪比（S/N）≥3的低濃度作為奶粉中左旋肉 堿的檢出限，測(cè)得左旋肉堿檢出限為5 mg/Kg。
7. 精密度與回收率
按實(shí)驗(yàn)方法，取市售奶粉樣品進(jìn)行不同濃度加標(biāo)試 驗(yàn)，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定左旋肉堿平均回收率和精密度， 結(jié)果列于表2，該方法的回收率在92.3%～105.2%之間， RSD在1.4%～4.3%之間。
實(shí)際樣品分析:
按實(shí)驗(yàn)方法，惠氏膳兒加產(chǎn)品包裝上左旋肉堿標(biāo)示 含量為7.7 mg/100 g、本文所測(cè)結(jié)果與之接近。惠氏愛(ài)兒 樂(lè)和伊利奶粉包裝上未標(biāo)識(shí)添加有左旋肉堿，但本試驗(yàn) 依然檢出，這可能與天然奶源中就含有一定量左旋肉堿 有關(guān)。
結(jié)論
采用閥切換-非抑制型離子色譜法來(lái)測(cè)定奶制品中的 左旋肉堿，具有簡(jiǎn)單、快速、干擾少、環(huán)保等特點(diǎn)。相 比常見(jiàn)的其它測(cè)試方法，避免了繁瑣的前處理，無(wú)需衍 生化，節(jié)約時(shí)間，重復(fù)性好，檢出限能滿(mǎn)足要求。該方 法可用于奶粉中左旋肉堿的含量測(cè)定。
但本方法也有不足，即無(wú)法區(qū)分左旋肉堿和右旋肉 堿，這是作者仍需繼續(xù)研究的課題之一。
