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基于 Orbitrap平臺的簡單快速抗體藥物天冬氨酸異構化解析
閱讀：4077 發布時間：2019-4-28關鍵詞 Fusion、 Proteome Discoverer、單抗、天冬酰胺脫氨基化、 天冬氨酸異構化
1. 前言
進入臨床實驗和正在研發的單抗藥物日趨增加，對于單抗 藥物的安全性和有效性評價的測試也越發重要。與小分子 藥物相比，單抗藥物更易在生產、運輸和儲存的過程中， 發生各種翻譯后修飾的變化，比如單抗中甲硫氨酸和酪氨 酸氧化，天冬酰胺脫酰胺化，天冬氨酸異構化等都會影響 藥物分子的穩定性，同時影響蛋白的結構和功能。因此， 對各種翻譯后修飾的質控分析也提出了更高要求。目前使 用 LC-MS/MS 在線分析質譜技術，在常規的肽圖分析中， 可以同時對多種翻譯后修飾進行定性和定量分析，比如甲 硫氨酸氧化、N 糖基化、天冬酰胺脫酰胺化，但對于天冬 氨酸異構化我們關注的都比較少，本文我們為大家提供更 加完整的天冬氨酸異構化解決方案，有助于單抗藥物的精 細質控分析。
天冬氨酸（D）異構化是一種自發性的非酶翻譯后修飾， 發生異構化后的天冬氨酸（isoAsp）, 在蛋白骨架中插入了 一個亞甲基，也就是同時天冬氨酸側鏈減少了一個亞甲基， 如圖 1 所示，因此引起蛋白結構的變化，從而引起蛋白功 能的變化。抗體 CDR 區域中天冬氨酸異構化已被證實會 降低受體結合效率，影響終的藥效。位于鉸鏈結構區域， 或者位于 DG/DS（G 為甘氨酸，S 為絲氨酸）區域的天冬 氨酸易發生異構化。同時在弱酸性溶液中，會增加天冬氨 酸異構化的水平。在天冬酰胺（N）發生脫酰胺化時，會 伴隨帶來天冬氨酸異構化，并且異構化的水平和非異構化 的水平基本在 3:1 的比例，一般包含 NG 區域和 PENNY（P 為脯氨酸，E 為谷氨酸，Y 為酪氨酸）區域的天冬酰胺易發生脫酰胺化，并帶來天冬氨酸異構化。由于異構化本身 不會引起分子量和電荷的變化，因此大大增加分析的難度。 在完整蛋白的水平上，可以使用離子交換和親和色譜進行 天冬氨酸異構化分析，不過對于低豐度的異構化水平就無 法準確確定，因此，我們需要在肽段水平上進行天冬氨酸 異構化的分析，當使用反相色譜（RP）進行分析時，一般 異構化的肽段會優先于未異構化的肽段被洗脫下來，不過 在受到柱子填料和流動相添加離子對試劑等因素影響時， 同樣會出現晚于未異構化肽段流出的現象。目前，在常用 的碰撞誘導激活解離（CID）和高能碎裂（HCD）進行二 級碎裂時，無法通過碎片離子進行天冬氨酸異構化的確認。 ETD 作為一種補充碎裂方式，尤其在進行長肽段，翻譯后 修飾肽段和完整蛋白水平分析時，可以提供與 CID/HCD 互補以及 ETD 特征性的碎片離子，從而準確的確定氨基酸 序列以及翻譯后修飾位點的信息。本篇中使用電子轉移解 離（ETD）時，包含天冬氨酸異構化的碎片會產生相應的 特征質量增加，如圖 2 所示，因此可以準確的判斷天冬氨 酸異構化的位點。
本文基于Thermofisher 新的三合一超高分辨質譜儀 Orbitrap Fusion Lumos, 采用ETD 碎裂方式，建立了天冬 氨酸異構化質譜解析方法，可以廣泛的應用到常規抗體藥 物肽段的精細解析中
2 實驗部分
2.1 儀器和試劑
質譜儀器：Orbitrap Fusion Lumos（賽默飛世爾科技，美國）；
色譜儀器：Easy nLC 1000液相色譜系統（賽默飛世爾科技， 美國）；
Dione×3000UPLC超高壓常規液相系統（賽默飛世爾科技， 美國）；
色譜柱：Home made Nano column（C18，2 µm， 75 µm×150 mm ，100 Å）；
Waters BEH（C18，1.7 µm，2.1×150 mm ，100 Å）
試劑：質譜級甲酸、二次去離子水，質譜級乙腈
2.2 儀器方法
色譜分析條件：具體見表 1；
質譜分析參數：具體見表 2；
2.3 數據分析方法
使用Proteome Discoverer2.1 軟件對原始譜圖進行氨基酸序 列分析，數據庫為抗體藥物對應的氨基酸序列，具體搜庫參 數為：半胱氨酸（C）烷基化（+57.021Da）設置為固定修 飾；甲硫氨酸 (M) 氧化（+15.995Da）和天冬酰胺（N）、谷 氨酰胺（Q）脫氨基化（+0.984Da）設置為可變修飾；酶切 為 trypsin；酶漏切位點為 2。
3. 結果與討論
經過 PD 檢索之后，通過設置脫酰胺化后修飾和查找包含 天冬氨酸異構化的特征碎片離子，在該抗體的酶解肽段中， 終準確鑒定到發生天冬氨酸異構化的肽段有兩條，該結 果與文獻報道的易發生天冬氨酸異構化的肽段一致 [1,2]。
條發生天冬氨酸異構化的肽段為 VVSVLTVLHQDWLNGK， 其二級碎裂譜圖如圖 3 所示，其中第 14 位的 N 發生了脫 酰胺化，并且在該過程中，產生了異構化的天冬氨酸，我 們可以觀察到 c13 和 c13+57 兩個特征碎片離子，如圖 4 所示，因此可以準確確定異構化的發生，同時我們也進行 了一級峰提取，不過由于這條肽段的非脫酰胺化形式和發生天冬氨酸異構化的形式疏水性差別不夠明顯，或者說目 前使用的反相色譜柱還沒有足夠的分離能力，因此該肽段 的不同翻譯后修飾形式無法得到有效的色譜分離，從而無 法進行準確的定量分析，期間為提高色譜分離效果，我們 嘗試使用常規液相分析，但是沒有得到很好的分離效果， 另外由于使用常規液相，反而降低翻譯后修飾肽段的檢出。 因此，推薦在不進行定量分析的情況下，我們優先考慮納 升級液相和質譜聯用進行高靈敏度的肽段翻譯后修飾檢 測。
第二條包含異構化位點的肽段為 GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK， 其二級碎裂譜圖如圖 5 所示，其中第 14 和第 19 位的 N發 生了脫酰胺化，并且在該過程中，第 14 位的天冬酰胺發生 了異構化，我們可以觀察到 c13 和 c13+57 兩個特征碎片離 子，如圖 6 所示，因此可以準確確定天冬氨酸異構化的發生。 同樣由于色譜分離度不夠，因此無法進一步的定量分析。
4. 結論 本文基于新的三合一超高分辨質譜 Orbitrap Fusion Lumos 分析平臺, 采用ETD 碎裂方式，建立了天冬氨酸異構化質 譜解析方法，為單抗藥物的準確、快速、精細解析提供了可 靠的分析手段，尤其當一些藥物質控分析中出現異常電荷異 質性或藥物異常降解時，可以進行肽圖水平的質譜分析