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雙特異性抗體是指能同時特異性結合兩個抗原或抗原表位的人工抗體。雙特異性抗體在自然條件下并不存在，而是通過細胞融合或重組DNA技術制備實現的。由于其特異性和雙功能性，現已成為抗體工程領域的研究熱點，在腫瘤治療及自身免疫病等領域中具有廣闊的應用前景。截止到2023年9月份，全球已獲批13款雙抗藥物（包括已退市的），從2022年初到現在就獲批了9款藥物（表1）。獲批的雙抗藥物涉及的靶點多樣，包括CD3、CD19、EGFR、cMET、PD-1、CTLA-4和BCMA等，探索的適應癥包括血液瘤、多發性骨髓瘤、血友病和非小細胞肺癌等。表1. 獲批上市的雙抗藥物
鑒于雙抗藥物潛在的療效和安全性優勢，國內外企業紛紛布局雙抗領域，國內共有300余款雙抗在研藥物，其中進入臨床階段的藥物近100款。康方生物、康寧杰瑞、百濟神州、恒瑞醫藥、信達生物、貝達藥業、澤璟制藥等深耕于雙抗賽道。其中，康方生物的卡度尼利是上市的國產雙抗藥物，今年有望納入醫保。由于工程化雙抗擁有兩個不同的抗原結合臂，致使其生產制備變成了一個復雜且具有挑戰性的過程。具體挑戰包括：正確的鏈配對、同源二聚體污染、產量、正確的蛋白質折疊和翻譯后修飾。以抗體設計為主導的解決方案和創新工藝技術的結合使得克服其中許多挑戰成為可能，但雙抗生產的復雜過程特別需要強大且可靠的表達平臺，包括：表達載體：理想表達載體將目標分子所有鏈以比例進行基因組整合和表達。盡管多表達盒載體可以提供便利，但將雙特異性抗體的每一半引入單獨的載體中，微調它們各自的表達水平亦可實現配對。細胞系：工程化雙特異性抗體的表達需要強大的宿主細胞系，廣泛使用的為中國倉鼠卵巢細胞CHO，因為它不僅需要有效的鏈配對，還需要正確的翻譯后修飾、折疊和分泌。早期質量篩選：細胞池和克隆篩選過程中的早期質量分析有助于評估鏈配對效率、折疊模式和潛在的聚集風險。工藝優化：即使使用優化的細胞系和載體，同源二聚化仍然是雙特異性生產的潛在障礙。通過優化細胞培養過程和純化策略，提高所需分子的產量。本案例以最新的轉座子載體為載體平臺，嘗試在業界推崇的GS 敲除的CHO細胞中表達不對稱 4 鏈雙特異性抗體。以獲得高表達且正確組裝的異二聚體構象為目標，檢測CHOSOURCE™蛋白表達平臺對雙抗細胞株構建的表現。
CHOSOURCE™蛋白表達平臺簡介
瑞孚迪（Revvity） 公司旗下的CHOSOURCE™蛋白表達平臺匯集了強大的谷氨酰胺合成酶敲除 (GS KO) 的CHO 細胞和巖藻糖轉移酶敲除的ADCC+ CHO細胞系(可表達無巖藻糖基修飾的抗體蛋白)、轉座子載體技術。CHO細胞搭載轉座子載體用于高效表達單抗，融合蛋白等分子，已經得到多組實驗驗證。轉座子技術帶來的目標分子完整高效的基因組整合，顯著簡化和加速了細胞系開發(CLD)流程。
圖 1. CHOSOURCE 蛋白平臺和CHOSOURCE 轉座子技術. 轉座子技術是一個由轉座子載體和轉座酶mRNA組成的雙組分系統。轉座子載體本身含2個表達盒。目標基因(GOIs)克隆至載體后，轉座酶通過識別載體上的末端反向重復序列(TIR)，將含有GOIs(包括GS選擇盒)的序列整合到宿主細胞基因組中，實現目標基因的高效完整整合此外，結合瑞孚迪的微流控毛細管電泳分析系統LabChip® GXII Touch™ ，可以實現快速的蛋白關鍵質量屬性分析(純度，糖型，電荷異質性等)，將蛋白質量分析納入生物治療工作流程早期，可以顯著提高細胞株構建效率和質量控制。
實驗設計：不對稱 4 鏈雙特異性抗體，由兩條輕鏈(LC1和LC2)和兩條重鏈(HC1和HC2)組成，采用knobs-into-holes結構(圖2)。CHOSOURCE 轉座子技術由雙表達盒轉座子載體和轉座酶兩部分組成，因4鏈分子的表達需要2個載體，通過四條序列在2個載體上的不同配組得到8種載體和組合(圖3) ，兩載體間以1:1 比例同轉座酶 mRNA共轉染至 GS KO CHO宿主細胞中。
圖2. 使用CHOSOURCE 轉座子技術表達具有knobs-into-holes Fc區域的不對稱4-鏈雙特異性抗體[A]。正確的異二聚體抗體[A]會與一些不正確的鏈組合和自由鏈[B]共同表達，雜質種類復雜
圖 3. 使用 CHOSOURCE 載體表達 4 鏈雙特異性抗體，兩個 轉座子載體與 轉座酶 mRNA 共轉染GS KO 的CHO 細胞。圖示本測試中構建的8個不同的載體， 8種不同轉染組合條件下各個載體的配組情況
實驗結果：
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細胞池篩選恢復和整合拷貝數分析
轉染后無需選擇劑甲硫氨酸亞砜亞胺(MSX)，6個組合的細胞池在8~13天即完成篩選恢復，2個恢復慢的組合在16天時達到培養階段(圖4)。恢復時間的差距表明每個載體內的抗體鏈位置對細胞池的選擇恢復有影響，這可能是由于不同位置的抗體鏈的表達水平不同。
圖4. 共轉染后細胞池的選擇恢復概況。圖(A)代表活細胞密度，圖(B)代表活力百分比。誤差線代表兩個獨立轉染細胞池的標準偏差評估每個細胞池中載體的整合情況(圖5)，我們發現同一表達載體中的 HC 和 LC 及GS基因以 1:1:1 的比例整合到每個細胞池中。例如，在共轉染條件3中，載體1中LC1和HC1確定的拷貝數均為15，載體2中HC2和LC2確定的拷貝數為11，它們組合起來與觀察到的 GS 基因的 26 個拷貝相匹配。8個pool中GS 基因拷貝數基本等于兩個重鏈或輕鏈的所在載體拷貝數之和，同以往的實驗結果相一致，說明了 轉座酶介導完整的目標序列轉座。
圖5. 不同轉染組合條件下目標基因拷貝數插入情況。篩選恢復后每個共轉染組合條件下細胞池中四條目標抗體序列(LC1、HC1、LC2、HC2)和篩選基因GS的插入拷貝數檢測 (ddPCR方法，每個樣本三次重復)由于兩載體以 1:1 的比例共轉染，預計每個庫中會整合相同數量的四個鏈拷貝。實際情況并非如此。僅轉染組合條件 4、7 和 8下，所有四個鏈的數量幾乎相等；在共轉染條件 1 中，含有“knobs”HC (HC2) 的載體比含有“holes”HC (HC1) 的載體整合更少的拷貝數(7：14；大約一半)，這也意味著可以調整載體的比例，以增加特定分子的整合。
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細胞池生產力和質量評估
恢復后的8組測試細胞池經14天的簡單fed-batch培養（培養條件未優化），初步評估哪個組合配置產能有優勢。雙抗的產量數據顯示：具有相似拷貝數的六個共轉染池的抗體產量在相同范圍內，并且高于1g/L，而其余兩個池拷貝數最少，產量也較低(圖6)。“LC1HC1_HC2LC2”(共轉染條件 3)配置具有最高數量的整合拷貝，產生了最高的總體抗體滴度。
圖 6. 八個共轉染細胞池的雙抗生產力初步評估（14天fed-batch 培養）使用微流控毛細管電泳LabChip GXII Touch HT 系統，利用 ProteinEXact 試劑盒進行八組載體配置下純化抗體的非還原和還原電泳分析，并與參考雙特異性抗體對照進行比較(圖7，表2)。微流控毛細管電泳技術可以可以根據蛋白質的大小，高效分離非還原樣品的不同構象，如異二聚體、同二聚體、糖基化和非糖基化變體以及游離鏈等，速度達到~1分鐘/樣品，并具備靈活通量(1-384樣本/輪)，對于分析還原樣品，可以實現單個抗體鏈的鑒定和定量。比較八個載體配置下蛋白電泳圖譜發現（圖7），雖然“LC1HC1_HC2LC2”(共轉染條件3)具有最高的抗體滴度，但表達的抗體譜與參考分子不同。共轉染生成該池的兩個載體內兩條重鏈和輕鏈的前后位置導致 LC2 鏈表達減少，這可能妨礙了分子的正確組裝。結合還原蛋白電泳圖譜，“LC2HC1_LC1HC2”(共轉染條件 8)顯示出更多優勢，不僅峰型與對照分子相近，四個抗體鏈的存在比例與參考分子的比例也非常相似。
圖 7. LabChip GXII Touch HT 系統評估 8 個配組組合及參考雙抗的非還原和還原狀態下蛋白的μCE-SDS情況。非還原蛋白樣品的電泳圖譜如 [A] 所示。還原蛋白樣品的電泳圖譜見[B]圖，條形圖代表各條鏈的濃度百分比(%)利用LabChip GXII Touch HT的軟件細致分析“LC2HC1_LC1HC2”(共轉染條件 8)產生的抗體異構體與參比分子的異同（表2），共轉染條件 8雖然表達滴度比條件 3 稍低(1.2g/L vs 1.4g/L)，但構象正確率達到94%。是這批實驗中綜合表現良好的組合，鑒于產量和質量評估對于確定細胞系開發流程中最佳細胞池同樣重要，共轉染條件 8得到的細胞池適合進入下一步單克隆篩選 。表2. 對于LC2HC1_LC1HC2(共轉染條件 8)樣本抗體，微流控毛細管電泳中的各個峰相對于參考雙抗分子的蛋白質量分析。[A，B] 非還原蛋白樣品的各峰比較， [C，D] 還原蛋白樣品的各峰比較
結論在這項工作中，我們使用 CHOSOURCE 轉座子載體技術表達不對稱 4 鏈雙特異性抗體。初次嘗試變獲得高表達且正確的異二聚體構象是雙抗生產的目標（條件8）。本研究只測定了兩種載體以 1:1 的共轉染比例產生的正確抗體構型的情況，由于雙特異性抗體的基因組整合和表達的動力學的復雜性，兩個載體還可以嘗試以不同的比例共轉染以產生更佳的正確的異二聚體配置。CHOSOURCE 轉座子技術雙盒載體提供了調節雙特異性抗體不同鏈表達的靈活性。這不僅可以通過測試兩個載體不同比例的共轉染來實現，還可以通過測試不同的鏈位置來實現。CHOSOURCE 轉座子技術搭載 GS KO 細胞系，能夠在轉染后約6 周內評估細胞池階段的蛋白質質量，鑒于轉座子帶來的完整高效整合，有助于高效實現CLD的開發。雙特異性抗體分子設計的進步，例如knobs-into-holes 結構，顯著減少了錯配和同源二聚體污染。然而，“孔-孔”同二聚體和共純化的游離鏈仍然存在挑戰，故在細胞系開發過程的早期納入質量分析變得很關鍵。瑞孚迪 的微流控毛細管電泳 LabChip GXII Touch HT 系統，高效率分析還原和非還原樣本的多項蛋白表征（滴度，純度，電荷異質性，片段化，聚體，糖基化程度及糖譜等），1分鐘/樣本的速度和1-384樣本/輪的靈活通量，可進一步提高生物制品開發的速度。在本研究中，LabChip GXII Touch HT 系統可以對細胞池表達的抗體進行快速表征分析，可以幫助在細胞系開發時及早識別最佳的細胞池。總之， 瑞孚迪 的 CHOSOURCE 表達平臺和 LabChip GXII Touch HT 系統的強強聯手，可以大簡化和加速復雜抗體類分子的細胞系開發過程，促進生物治療藥物的開發和進步。
