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今年我們非常榮幸請到圣裘德兒童研究醫院Dr.Jessica Wagner和福克斯詹士癌癥中心的 Dr.Harvey Hensley為大家分享:使用分子影像技術在體內和體外水平揭示小分子藥物 ONC201的抗腫瘤活性和免疫刺激作用。以下是報告的精彩內容：
ONC201背景介紹
在2013年以前，美國濱州州立大學(PennState University)和濱州赫爾歇醫療中心(Penn State Hershey MedicalCenter)的研究人員，通過篩選 NCI的免費分子庫得到是一種高效的 抗癌分子，即ONC201 (又稱TIC10或NSC350625)。
在2013年，Allen實驗室發表的文章中顯示，TIC10,也就是ONC201可以誘導腫瘤細胞 TRALL（重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體）的水平，對激酶AKT和MEK實施雙重 抑制，導致轉錄因子FOXO3a去磷酸化，去磷酸化的FOXO3a發生從細胞質進入細胞核的 易位作用，在核內結合編碼基因TRAIL的啟動子上調其轉錄。同時在活體實驗中顯示出 單次劑量的有效性、令人欣喜的安全性和藥代動力學。
Joshua E. Allen et al. Sci Transl Med 5, 171ra17 (2013);
在多個細胞系模型和包括結腸癌、乳腺癌和腦瘤等異種移植實體瘤模型中，發現ONC201 通過誘導TRAIL介導而引發的細胞凋亡促進腫瘤消退。此外，ONC201還表現出了較好的 藥物特性，如穩定性好，口服生物利用度高和良好的血-腦屏障通透性。目前ONC201正 在各種惡性腫瘤中進行早期臨床試驗測試。
在2016年kline實驗室發表的論文中，證實ONC201上調死亡受體DR5和ISR（整合應激 反應）進行腫瘤的殺傷。同時，ONC201通過雙重阻礙Akt和ERK,從而釋放Foxo3a進入 核并且激活TRAIL基因的轉錄，從而上調內源性TRAIL表達Dr.Jessica Wagner 實驗室發現 ONC201通過類似于細胞效應引發的壓力信號誘導eIF2-a-依 賴的活性轉錄因子ATF4和CHOP，增加DR5的表達，誘導細胞死亡。
研究正文
Dr.Jessica Wagner 在 2018年發表在 JCI雜志上的文章中，主要證實了以下三個結論。
增加ONC201劑量和頻率，療效會隨之增強（引導正在進行的臨床試驗更改ONC201的 劑量）;
ONC201 在活體水平可以抑制原位和轉移的腫瘤，在體外水平也證實了可以抑制浸潤和 遷移；
ONC201誘導NK細胞在腫瘤細胞中的累積和激活。
模型選擇
為了證實以上結論，Dr.Jessica Wagner采用了幾種動物模型，小鼠皮下腫瘤模型、原位接 種模型及腫瘤轉移模型。在轉移模型中發現，Vehicle 組的小鼠在肺部出現四個轉移位點， 在ONC201治療組并未發現轉移位點。
小鼠腫瘤轉移模型
皮下/原位接種腫瘤細胞形成原位腫瘤： 小鼠形成微小的轉移位點
手術去除原位腫瘤 ：原位腫瘤直徑大小在6-10mm時進行去除； 2-5 個月形成轉移位點，時間取決于細胞系。
尾靜脈注射方式 ：最后一個模型是相對比較快速的，需要2-3周。尾靜脈注射的方法也是經典的 方法，注射之后細胞會在肺部積累。雖然這個方法比較快速，但是不是優選的 模型。一般是在原位腫瘤未發現浸潤的時候，才將腫瘤細胞接種在血液中。
檢測方法
在這篇文章中，大量采用Revvity公司的影像系統來監測腫瘤的生長和轉移，使用小 動物活體成像平臺及多光譜成像系統監測生物發光信號和 GFP 的熒光信號。使用 IVIS系統進行生物發光成像，可以非常容易監測皮下和原位腫瘤的生長。
實驗結果
1. 增加ONC201 劑量能夠抑制腫瘤的生長和轉移
ONC201 對腫瘤的生長和轉移的抑制作用具有劑量依賴性。加入每3周一次的注射 頻率在臨床是耐受的，臨床前實驗提示證實，通過劑量增強可以增加ONC201的抗 腫瘤效果。文章發現，在結腸癌HCT116 p53–/–, HT29, 和乳腺癌MDA-MB-231模型 中，增加ONC201劑量，治療增強。
同樣Dr.Jessica Wagner2018年發表在JECCR的文章中，使用熒光成像觀察HCT116 –GFP腫瘤，并 使用探針superhance 680 觀察腫瘤血管影像，從腫瘤的影像可以看出，Vehicle處理組腫瘤內部具有 豐富的血流，ONC201處理組并沒有大量的減少血管的量，而血管靶向藥物Bevacizumab明顯的減少 腫瘤血管的數量。這些結果提示我們可以將ONC201和抗血管類的藥物聯合使用進行腫瘤治療。
生物發光檢測轉移位點
使用IVIS系統對解剖后肝臟及肺部的轉移位點進行生物發光的成像，MDA-MB-231轉移模 型中，可以看出ONC201治療組的腫瘤明顯小于對照組，并且發生率也低于對照組，甚至 25mg/kg4周注射一次，都能達到治療效果。
熒光成像檢測轉移位點
手術去除原位腫瘤（HCT116GFP）,在轉移性形成時給予治療vehicle 或100 mg/kg ONC201，測量最后轉移腫瘤的數量和大小。從圖中可以看出轉移位點出現在結腸和肝臟 的位置。ONC201治療組可以明顯減少腫瘤的轉移。
Micro CT成像技術檢測轉移位點
進一步使用Revvity公司Quantum Micro CT系統檢測ONC201在小鼠轉移模型中的抗轉移的 效果。使用HT29尾靜脈注射模型，經過ONC201或Vehicle治療后，可以看到ONC201 可以 減小肺部轉移位點的體積，而Vehicle處理組腫瘤在持續生長。
組織定量病理成像
使用Vectra全自動定量病理系統結合Inform軟件對IHC組織進行成像和分析，檢測微弱表達 的生物標志物。Inform軟件具有自學習功能，通過訓練可以快速的區分腫瘤實質、間質及 其他區域，并且進行定量。我們選用MDA-MB-231細胞系及MDA-MB-231shTRAIL細胞， 接種在小鼠體內。Vehicle 或ONC201治療四周后，每個腫瘤組織取兩張切片使用Vectra系 統進行掃描，整張切片使用Inform進行分析。有趣的是，在野生型腫瘤模型中，Vehicle 或 ONC201治療組cleaved caspase-3表達有輕微的區別，而Ki-67+ 細胞的數量相差很大。 shTRAIL tumors模型中并沒有明顯的變化。這些結果說明ONC201對腫瘤轉移的抑制作用 至少部分是TRAIL-依賴途徑下調腫瘤細胞的遷移和入侵的方法實現的。
參考文獻：
1. Jessica Wagner et al., Dose intensification of TRAIL-inducing ONC201 inhibits metastasis and promotes intratumoral NK cell recruitment J Clin Invest. 2018;128(6):2325-2338.
2. Jessica Wagner et al. Anti-tumor effects of ONC201 in combination with VEGF-inhibitors significantly impacts colorectal cancer growth and survival in vivo through complementary non overlapping mechanisms Journal of Experimental & Clinical Cancer Research (2018) 37:11.
3. Allen JE, et al. Dual inactivation of Akt and ERK by TIC10 signals Foxo3a nuclear translocation,TRAIL gene induction, and potent antitumor effects. Sci Transl Med. 2013;5(171):171ra17.
