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EnVision在高通量SNPs分型檢測中的應用

2023-11-29  閱讀(130)

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單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)是DNA序列中單個核苷酸替換導致的,通常SNP位點構成兩個等位基因。在人類基因組中,具有豐富的SNPs,據預測每1000個堿基就會有1個SNP發生。SNPs位點與許多人類疾病相關,包括癌癥、代謝疾病、自身免疫疾病、神經性疾病、傳染病等。另外,研究SNPs對畜牧養殖、農作物育種也有非常重要的意義。對于SNPs分型分析除了傳統的DNA測序、毛細管電泳、質譜、色譜法,我們還可以通過EnVision多功能酶標儀的多種檢測模式進行高通量SNPs分型分析。

方案一

經典的FP-TDI單核苷酸多態性檢測

FP-TDI(template-directed dye-terminator incorporation assay with FP detection)是經典的SNPs分型檢測方法,如下圖,定序引物是一種未經修飾的引物,其3’端靠近多態或突變位點的上游。當加入不同熒光團標記的ddNTP、DNA聚合酶和靶標DNA孵育時,等位基因特異性標記ddNTP與TDI引物結合。激發反應中的熒光染料來檢測FP信號的變化,可以簡單快速地確定靶標DNA分子的基因型。應用EnVision FP檢測模式,不論是單鏈合成DNA寡聚核苷酸還是PCR擴增產物雙鏈DNA片段,都可以作為FP-TDI檢測模板,檢測方法的高靈敏、高特異性得到驗證。




方案二

AlphaScreen均相SNPs分型檢測技術

AlphaScreen技術可用于開發高通量核酸檢測,如下圖,通過通用寡核苷酸將探針分別橋聯在供體和受體微珠上,通過探針結合靶基因序列達到檢測目的 。這種方法可以檢測到濃度低至10amole的單鏈DNA。AlphaScreen與等位基因特異性擴增(ASA)和等位基因特異性雜交(ASH)的結合,可開發兩種均相單核苷酸多態性(SNP)基因分型平臺。這兩種類型的檢測都非常靈活、穩定、準確,每個基因型的基因組DNA樣本含量僅需2ng。使用ASA分析對12個SNPs和使用ASH分析的7個SNPs進行了AlphaScreen驗證研究。580多個樣本進行了基因分型,準確率>99%。這兩種檢測方法非常簡單,不需要PCR后操作。在96孔和384孔板中成功地進行了基因分型,體積低至2μL,大大減少了基因分型所需的試劑和基因組DNA的數量。



方案三

基于化學發光雙報告基因檢測的SNPs功能分析

SNPs調控的蛋白表達,在畜牧養殖、育種有著非常重要的意義。β-乳球蛋白是牛奶中主要的乳清蛋白,約占牛奶總蛋白的10%,但有可能導致食用后過敏。一項關于雜合子奶牛乳汁中BLG B亞型濃度的全基因組關聯研究(GWAS)檢測到BLG基因內或附近存在一組高度顯著的單核苷酸多態性(SNP)。其中BLG基因第1外顯子+78 bp處存在同義G/a突變(chr11:103256256G>a)。在轉染的CHO-K1和MCF-7細胞中的熒光素酶報告分析中評估了該SNP的A等位基因(稱其為B’)對BLG表達的影響,通過EnVision化學發光雙報告基因檢測發現,B’純合子大大降低BLG蛋白表達量。另外發現,攜帶B’ BLG等位基因奶牛產奶所含的酪蛋白含量非常高,有助于提供乳酪產量。因此,通過高通量SNPs篩選,可以獲得優良的品種。




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