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電轉百科指南⑥:CRISPR基因編輯的轉染技巧與注意事項(下篇)

2023-11-20  閱讀(160)

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02/下篇

Knock-in

對于Knock-in,目前還存在一定的難度,大多數的出版物只能實現10-40%的敲入效率,不同位點也存在差異。Nature Biotechnology今年5月的一篇出版物利用SLEEK (SeLection by Essential-gene Exon Knock-in)技術可以在T細胞上實現超過90%的KI效率,同樣在其他常用的免疫細胞如NK,B cell,IPSC等細胞都實現了非常高的KI效率。

對于常規的KI實驗,我們依然可以從以下方面考量進行進一步優化:


Donor DNA用量的測試



▲ Theodore L Roth et al., 2018



▲ Zelda Odé et al., 2020


HA長度

HA的長度會影響KI的效率,但并不意味著越長越好。



▲ Zelda Odé et al., 2020



▲ Soyoung A. Oh et al., 2022


HA修飾



▲ Brian R. Shy et al., 2021



▲ Jonas Kath et al., 2022


特殊成分提高HDR效率的測試

也有文獻結果表明PGA對KI的效率沒有幫助,僅供參考。



▲ Ya-Wen Fu et al., 2021



▲ David N. Nguyen et al., 2020


選擇dsDNA或ssDNA或AAV載體進行KI

dsDNA會隨著用量的增加顯著增加對細胞活率的影響。



▲ Theodore L Roth et al., 2018


HDR Enhancer



▲ Jonas Kath et al., 2022


甚至HDR, RNP, 細胞的混勻順序也可能會對結果造成影響



▲ Theodore L Roth et al., 2018


電轉前后培養體系



▲ Theodore L Roth et al., 2018


Nucleofection 條件優化

通常可以參考KO的條件進行KI實驗,但依然可以依照具體的實驗需求調整。



▲ Theodore L Roth et al., 2018



▲ Soyoung A. Oh et al., 2022


對于Knock-in,還可以通過其他手段提升結果,如PAM and Track mutations, 具體內容可以參考如Cas蛋白或sgRNA供應商。


通常KO不會對細胞的活率產生太大影響,但是對于KI,需要用到donor DNA,如dsDNA,或者使用更強的電轉染條件,這些可能會導致活率的負面影響。


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