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在顯微鏡檢查中,景深是一個非常重要的參數 。在實際操作中,會根據數值孔徑、分辨率和放大率之間的相關性確定該參數。為了獲得最佳視覺效果,現代顯微鏡的調節設備在景深和分辨率之間實現了最佳平衡,這兩個參數在理論上呈負相關。
人眼景深實際值
DIN/ISO標準將物體側面的景深定義為“物體平面兩側空間的軸向深度,物在該深度范圍內移動時沒有可檢測到的圖像清晰度損失,且圖像平面和物鏡的位置保持不變"。
然而,該標準沒有給出任何關于焦點虛化檢測閾值的測量方法。Max Berek是就人眼景深發表文章的作者,早在1927年,他就已經將自己通過廣泛實驗獲得的結果公布于世。Berek公式給出了人眼景深的實際值,至今仍在沿用。簡化公式如下:
TVIS = n [λ/(2 × NA2) + 340 μm/(NA × MTOT VIS)]
TVIS:人眼景深
n:物體所處介質的折光率。如果物體移動,則將導致工作距離變化的介質折光率代入等式。
λ:所用光源的波長,如果是白光,λ = 0.55 μm
NA:物體側面的數值孔徑
MTOT VIS:顯微鏡的總視角放大率
如果在上述等式中,將總視角放大率替換為有效放大率(MTOT VIS=500至1000×NA),可以看出,采用一級近似值時,景深與數值孔徑的平方成反比。
圖1:λ=0.55 μm和n=1時作為NA函數的景深
在放大率低時,縮小光圈(即減小數值孔徑)可以顯著延長景深。一般可用孔徑光闌或共軛平面上的光闌來完成這一操作。但數值孔徑越小,橫向分辨率越低。
因此,問題在于如何根據物體結構找到分辨率和景深之間的最佳平衡點。借助高分辨率物鏡(高NA)和可調孔徑光闌,現代光學顯微鏡能夠根據特定樣品的要求靈活匹配光學器件。在體視顯微鏡中,考慮到三維結構中z維度的要求,通常需要作出一些妥協以獲得更大景深。
更大的景深
Leica Microsystems采用了一種復雜的光學方法來消除體視顯微鏡中分辨率和景深之間的相關性,這種方法就是FusionOptics™。該設備提供了一條光路方便觀察者單眼觀察分辨率高但景深短的圖像。另一只眼可通過第二條光路觀察到同一物體,但此時分辨率低而景深長。
人腦將兩個獨立的圖像組合成一個最佳的整體圖像,即同時具有高分辨率和長景深的特征。
還有一個示例也闡明了人腦的非凡能力,即Greenough體視顯微鏡。在這個顯微鏡中,左光路和右光路中的物體平面之間存在微小角度。在整個圖像中,整個陰影區域看起來是清晰聚焦的,但左圖像或右圖像中的并非如此。
圖2:具有景深范圍的Greenough體視顯微鏡中的物體平面
數字圖像處理中的景深
Leica應用程序組(LAS X)的多聚焦模塊旨在多次通過多次聚焦來增加自動顯微鏡的景深。用戶可以單獨設置照明、圖像亮度和所有其他相機參數,以優化所獲圖像的質量。
利用LAS X多聚焦模塊,在顯微鏡和主動對焦的一體化控制下,可以輕松捕獲具有更大景深的實時圖像。z堆棧的自動捕獲以及智能圖像組合算法確保可以輕松拍攝并存儲清晰的聚焦圖像。
由于存在自動化處理例行程序,用戶幾乎無需干預。可針對各種樣品輕松更改此類設置。多聚焦模塊適用于材料科學、法醫學以及生物和地球科學方面的應用程序。
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