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犬用干細胞分泌因子注射劑的制作方法

技術實現要素：

本發明提供了一種犬干細胞注射劑的制備方法及其應用。該犬干細胞注射劑在治療犬貧血、犬白細胞減少癥、犬非感染性中樞神經系統損傷、肝功能損傷、腎功能損傷、糖尿病、犬退行性關節炎、關節軟骨缺損等疾病具有*優勢，顯著縮短療程，提高患犬生活質量且無任何副作用，同時對于體質衰弱的老年犬也具有增強體質和抗病力的作用。

本發明犬用干細胞分泌因子注射劑，其特征在于其注射劑中含有犬干細胞分泌因子原液，該原液由A液和B液按3:1的體積比混合而成；其中，A液為犬干細胞裂解液，B液為犬MSCs和HSCs無血清培養上清液融化、混合、低溫分離、超濾和濃縮后形成。

所述的犬用干細胞分泌因子注射劑，其特征在于犬干細胞分泌因子原液中，按質量，加入原液0.5%-1%的甘氨酸，0.2%-0.5%的黃芪多糖，0.3%-0.6%的香菇多糖。

所述的犬用干細胞分泌因子注射劑，其特征在于按質量，加入原液0.15%-0.2%的甲鈷胺，0.3-0.5%的維生素B1，0.05-0.1%的維生素B12。

所述的犬干細胞分泌因子注射劑是注射液或是注射用凍干粉。

所述的犬干細胞分泌因子注射用凍干粉是用真空冷凍干燥機經真空濃縮、噴霧干燥，得到犬干細胞分泌因子凍干粉。使用時注射用生理鹽水進行稀釋，每100ml生理鹽水中添加犬干細胞分泌因子注射用凍干粉80mg。

所述的犬用干細胞分泌因子注射劑，其特征在于該犬干細胞分泌因子原液是通過以下步驟制備而得：

（1）犬干細胞裂解液的制備：將體外培養獲得的MSCs和HSCs混合密封于凍存管中，經超低溫液氮反復凍融至細胞破碎，再經中空纖維超濾柱超濾，再用濾膜過濾，使其無菌，測定蛋白濃度，調整濃度為0.5mg/ml，標記為A液；

（2）將收集后的犬MSCs和HSCs無血清培養上清液融化、混合、低溫分離、超濾和濃縮；利用超濾膜過濾濃縮，再經中空纖維超濾柱超濾，將超濾后的液體進行濃縮，用濾膜過濾，使其無菌，測定蛋白濃度，定濃度為0.5mg/ml，4℃保存，標記為B液；

（3）將上述A液和B液按3：1的體積比混合，得到犬干細胞分泌因子原液。

本發明的犬干細胞分泌因子注射液或凍干粉既可以靜脈滴注，也可以局部注射，如脊髓穿刺或關節腔注射。將本發明的犬干細胞分泌因子注射液或凍干粉在全國試點寵物醫院進行推廣試用，應用在犬貧血、犬白細胞減少癥、犬非感染性中樞神經系統損傷、肝功能損傷、腎功能損傷、糖尿病、犬退行性關節炎、關節軟骨缺損等疾病的治療，等300余例進行治療，相對于常規治療，本發明的犬干細胞分泌因子注射液/凍干粉*明顯上升，生活質量顯著提高；所有病例未出現任何不適癥狀，無毒副作用，安全性好。

具體實施方式：

實施例1：犬用干細胞分泌因子注射液，通過以下的方法制備：

1、在本發明中所述的MSCs包括從犬骨髓、脂肪、臍帶或胎盤中分離培養的犬間充質干細胞，用流式細胞術鑒定干細胞表面分子CD44陽性，CD34陰性。所述的HSCs包括從犬骨髓、臍帶血、胎盤中分離培養的犬造血干細胞，用流式細胞術鑒定干細胞表面分子CD34陽性，CD44陰性。中國專li申請號201410405353.X，公開號104152409A，以骨髓為來源，公開了犬MSCs和HSCs的獲得方法。

2、用無血清培養液對MSCs和HSCs進行培養，每六天對培養MSCs的上清液進行半量換液，收集培養后的上清液，測定干細胞分泌因子的各種成份和活性，濃縮后即為干細胞分泌因子。

3、制備犬干細胞分泌因子原液

（1）犬干細胞裂解液的制備：將體外培養獲得的MSCs濃度調整為1×107個/ml，HSCs濃度調整為1×107個/ml，各取0.5ml混合密封于凍存管中，經超低溫液氮反復凍融5－7次至細胞破碎，再經截留分子量為50KD中空纖維超濾柱超濾，便可獲得高純度的干細胞內生物活性物質群或組合物即為MSCs裂解液；用孔徑為0.22 µm的濾膜過濾，使其無菌，測定蛋白濃度，調整濃度為0.5mg/ml，標記為A液。

（2）將收集后的犬MSCs和HSCs無血清培養上清液融化、混合、低溫分離、超濾和濃縮；超濾和濃縮的處理方法為：利用3K的超濾膜過濾，體積濃縮 1/10，保留生物活性物質，再經截留分子量為50KD中空纖維超濾柱超濾，將超濾后的液體進行濃縮，即可得到含有豐富干細胞生物活性因子的組合物；用孔徑為0.22 µm的濾膜過濾，使其無菌，測定蛋白濃度，定濃度為0.5mg/ml，4℃保存，標記為B液。將上述30 ml的A液和10 ml的B液混合，得到犬干細胞分泌因子原液。

（3）將步驟（2）得到的犬干細胞分泌因子原液進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，分析結果顯示于圖1中。

（4）將步驟（3）中各蛋白條帶按分子量大小分別運用液相色譜-質譜聯用技術(LC-MS)檢測，結果如圖2，圖3，圖4所示，表明成功獲得了具有多種活性因子成份的犬干細胞分泌因子原液。

4、干細胞分泌因子注射液的制備

將所獲得的犬干細胞分泌因子原液中，加入原液質量0.5%-1%的甘氨酸，其目的是清除機體內自由基，促進干細胞分泌因子的旁分泌作用。加入原液質量0.2%-0.5%的黃芪多糖，加入原液質量0.3%-0.6%的香菇多糖，以延長干細胞分泌因子的持續作用時間，同時增強機體非特異性免疫功能。

5、用NaHCO3調整干細胞分泌因子注射液pH值為7.2-7.5。

實施例2：用于治療犬非感染性中樞神經系統損傷的犬干細胞分泌因子注射液，則在犬干細胞分泌因子原液中加入原液質量0.15%-0.2%的甲鈷胺，加入原液質量0.3-0.5%的維生素B1，加入原液質量0.05-0.1%的維生素B12，以提供營養神經的活性物質，增強干細胞分泌因子調動神經干細胞到受損的神經部位進行修復。其他制備步驟與實施例1相同。

實施例3：犬用干細胞分泌因子注射用凍干粉，是將實施例1的注射液用真空冷凍干燥機經真空濃縮、噴霧干燥，得到犬干細胞分泌因子凍干粉。使用時注射用生理鹽水進行稀釋，每100ml生理鹽水中添加犬干細胞分泌因子注射用凍干粉80mg

以上所述僅是本發明的優選實施方式。應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對犬干細胞分泌因子注射液/凍干粉做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。