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技術文章

PCR血液標本保存方法及注意事項

閱讀:392          發布時間:2024-11-13

    最好是用淋巴細胞分離液把單個核細胞分離出來,然后-80℃保存。外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的分離是免疫學研究中的一項基本技術。目前國內外分離PBMC的常用方法是葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法(ficoll-hypaque density gradient centrifugation),用此方法分離PBMC純度可達95%,淋巴細胞約占90%,其中T淋巴細胞占80%,B淋巴細胞占410%。ficoll-hypaque混合溶液,又稱淋巴細胞分層液,在分離人PBMC時,要求其比重為1.077;分離小鼠單個核細胞時比重為1.080;分離大鼠單個核細胞時比重為1.0841.087;分離馬單個核細胞時比重為1.090

原理 

血液中各有形成分的比重存在差異,利用比重為1.077、近于等滲的ficoll-hypaque混合溶液(又稱淋巴細胞分層液)作密度梯度離心時,各種血液成分將按密度梯度重新聚集。血漿和血小板由于密度較低,故懸浮于分層液的上部;紅細胞與粒細胞由于密度較大,故沉于分層液的底部;PBMC密度稍低于分層液,故位于分層液界面上,這樣就可獲得PBMC

 方法:

1.靜脈取血2ml,加入含肝素溶液(1050um1血樣本)的試管中,混勻,使血液抗

凝。用pH7.2 Hanks液將抗凝血稀釋1倍。

2.吸取2ml淋巴細胞分層液置于刻度離心管中,然后將離心管傾斜45O角,用毛細滴管將稀釋的全血沿管壁緩慢加至分離液上面,應注意保持兩者界面清晰。

3.18℃~20℃下,用水平離心機以2000r/min離心20min。離心后細胞分布如圖。

 4.用毛細吸管輕輕插到混濁帶,沿管壁輕輕吸出此層細胞,移入另一支離心管中。即要吸取所有單個核細胞,又要避免吸取過多的分層液或血漿,以免混入其他細胞成分。

5.Hanks液洗滌細胞3次。第一次2000r/min 10 min;第21500r/min 10 min,可去掉大部分混雜的血小板。

6.將沉淀細胞懸于培養基中備用。

注意事項:

  1、實驗所用玻璃器皿應該潔凈。如果制備的單個核細胞懸液用于細胞培養時,上述操作過程都要在無菌條件下進行,所用器材、試劑都應為無菌。

 2、實驗中的細胞得率與室溫及分層液比重等有關。分層液應避光4℃保存。

3、往淋巴細胞分層液中加入稀釋全血時,不得將血液沖入分離液中,須保持兩層液體的清晰界面。

 


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