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技術文章

?免疫PCR實驗主要程序及步驟

閱讀:279          發布時間:2024-10-21

PCR(聚合酶鏈式反應)是一種分子生物學技術,現在已經被廣泛運用于臨床和實驗室,用于擴增特定的DNA片段。它的基本原理就是在體外模擬細胞內DNA復制的條件,最終完成特定基因的體外復制。

主要程序:

(1) 抗原+生物素化抗體→抗原-生物素化抗體復合物;

(2) 加親合素→抗原-生物素化抗體-親合素復合物;

(3) 加生物素化DNA→抗原-生物素化抗體-親合素-生物素化DNA;

(4) PCR擴增生物素化DNA部分。

實驗步驟:

(1)制備生物素化DNA

將噬粒 BLuescript skt,用生物素標記的M13引物進行PCR擴增制備出含T3和T7引物序列的280bp DNa段,即為生物素化DNA。

(2)免疫PCR模式

1. 試劑

包被緩沖液:20mmol/L Tris-HCI(pH9.5),含150mmol/L NaCl和0.02%NaN3;

洗滌液:20mmol/L Tris-HCI(pH7.5),含150mmol/LNaCl0.1mmol/L EDTA和0.1%Tween20;

稀釋液:20mmol/L Tris-HCI(pH7.5),含150mmol/L NaCl0.45%脫脂奶及變性鮭魚精DNA (0.1mg/ml)。

2.操作

(1) 包被

用包被緩沖液稀釋抗原(BSA),加入微滴板中(45μl孔),4℃(約15h),用洗滌液洗板3次×5min。

(2) 封閉:

每孔加200μl含4.5%脫脂奶及變性鮭魚精子DNA(1mg/ml)、0.1mmol/L EDTA的20mmol/L Tris-Hcl(pH7.5)(含150mmol/L NaCl緩沖液,37℃溫育80min,洗板數次。

(3) 抗原抗體反應:

用釋釋液1:8000稀釋單克隆抗BSA抗體,每孔加50μl,室溫(22℃)下45min,洗板孔15次×10min,去除未結合的抗體分子。

(4) 鏈親合一蛋白A結合反應:

每孔加入50μl用稀釋液稀釋的已與生物素-pUC19結合的鏈親合素-蛋白A嵌合體,室溫(22℃)50min,使得嵌合體-pUC19結合于固相的抗原抗體復合物上,然后洗板15次×10min,再用無NaN3的TBS洗3次,然后即可將微滴板用于后面的PCR反應。

(5) PCR

實驗條件 50mmol/L KCI、10mmol/L Tris-HCI(20℃pH8.3)、1.5mmol/LMgCl2、明膠(10μg/ml)、0.8mmol/LdNTPs(每種0.2mM)、2μM引物(每一引物1μM)和TaqDNA多聚酶(50U/ml)。


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