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實時熒光定量 PCR (RT-qPCR)原理及熒光技術方法

閱讀:694          發布時間:2024-10-14

    實時熒光定量 PCR (RT-qPCR) 是一種用于實時擴增和檢測特定 DNA RNA 序列的分子生物學技術。該方法利用熒光染料或探針,當與擴增的 DNA RNA 分子結合時會發出信號,從而可以對目標序列進行量化。RT-qPCR 通常用于基因表達分析、病毒載量定量和基因突變檢測等應用。

RT-qPCR原理的三個主要步驟:

1 、反轉錄:

1)、使用逆轉錄酶和特定引物將RNA樣品反轉錄成cDNA

2)、該步驟將RNA模板轉化為更穩定且可擴增的DNA形式。

3)、反轉錄過程中使用特定引物。

2 、PCR擴增:

1)、使用特定引物對cDNA進行PCR擴增,這些引物環繞目標區域。

2)、PCR是一個循環過程,呈指數級擴增DNA模板的數量。

3)、PCR反應中包含熒光染料或探針,它們結合到擴增的DNA序列上并發出熒光信號。

3、 熒光實時檢測:

1)、使用實時PCR儀器實時監測熒光信號。

2)、熒光的數量與每個PCR循環中擴增的DNA數量成比例。

3)、使用專業軟件分析數據以確定循環閾值(Ct)值,該值表示熒光信號達到特定閾值水平所需的循環數。Ct值用于計算原始樣品中存在的目標DNA量,從而允許進行基因表達或病毒載量等定量分析。

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根據所使用的技術不同,實時熒光定量PCR可以分為:熒光探針和熒光染料兩種方法。

現將其原理簡述如下:

 1. TaqMan熒光探針

    TaqMan探針法是高度特異的定量PCR技術,其核心是利用Taq酶的3'5'外切核酸酶活性,切斷探針,產生熒光信號。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時,報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時,Taq酶的3'5'外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監測系統可接收到熒光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現了熒光信號的累積與PCR產物形成wan全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術既可進行基因定量分析,又可分析基因突變(SNP),有望成為基因診斷和個體化用藥分析的shou選技術平臺。

2. SYBR熒光染料

    PCR反應體系中,加入過量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈后,發射熒光信號,而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加wan全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進行結合,因此可以通過溶解曲線,確定PCR反應是否特異。SYBR熒光染料法定量PCR的基本過程是:

    ① 開始反應,當SYBR染料與DNA雙鏈結合時發出熒光;

    DNA變性時,SYBR染料釋放出來,熒光急劇減少;

    ③ 在聚合延伸過程中,引物退火并形成PCR引物;

    ④ 聚合完成后,SYBR染料與雙鏈產物結合,定量PCR系統檢測到熒光的凈增量加大。

    實時熒光定量PCR技術根據化學原理可以分為探針類和非探針類。探針類實時熒光定量 PCR 技術主要是利用與靶序列特異雜 交的探針來指示擴增產物的增加;非探針類實時熒光定量 PCR 技 術主要通過熒光染料來指示產物的增加。無論是探針類實時熒光 定量 PCR 技術還是非探針類實時熒光定量 PCR 技術,檢測的都是 擴增產物的增加量。但探針類實時熒光定量 PCR 技術增加了識別 探針的具體的流程,操作的難度較大。


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