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?PCR反應污染原因與對策
閱讀：371 發布時間：2022-10-17 PCR反應的最大特點是具有較大擴增能力與很高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產生。
一、污染原因
1、標本間交叉污染:標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染;標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導致標本間污染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。
2、PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.
3、PCR擴增產物污染:這是PCR反應中最主要最常見的污染問題，因為PCR產物拷貝量 大(一般為1013拷貝/ml)，遠遠高于PCR檢測數個拷貝的極限，所以極微量的PCR產物污染，就可造成假陽就可形成假陽性。
還有一種容易忽視，最可能造成PCR產物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染.據計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題.
4、實驗室中克隆質粒的污染:在分子生物學實驗室及某些用克隆質粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見。因為克隆質粒在單位容積內含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內的質粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力，其污染可能性也很大。
污染的監測
一個好的實驗室，要時刻注意污染的監測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。
防止污染的方法：
1、合理分隔實驗室:將樣品的處理、配制PCR反應液、PCR循環擴增及PCR產物的鑒定等步驟分區或分室進行，特別注意樣本處理及PCR產物的鑒定應與其它步驟嚴格分開。最好能劃分
①標本處理區;
②PCR反應液制備區;
③PCR循環擴增區;
④PCR產物鑒定區。其實驗用品及吸樣槍應專用，實驗前應將實驗室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA。
2、吸樣槍:吸樣槍污染是一個值得注意的問題。由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸入槍內或粘上槍頭是一個嚴重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時要十分小心，吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產生氣溶膠污染。
3、預混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應小量分裝，如有可能，PCR反應液應預先配制好，然后小量分裝，-20℃保存。以減少重復加樣次數，避免污染機會。另外，PCR試劑，PCR反應液應與樣品及PCR產物分開保存，不應放于同一冰盒或同一冰箱。
4、防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應一次性使用。
5、設立適當的陽性對照和陰性對照，陽性對照以能出現擴增條帶的低量的標準病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應都應有一管不加模板的試劑對照及相應不含有被擴增核酸的樣品作陰性對照。
6、減少PCR循環次數，只要PCR產物達到檢測水平就適可而止。
7、選擇質量好的Eppendorf管，以避免樣本外溢及外來核酸的進入，打開離心管前應先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動作要輕，以防管內液體濺出。