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交叉保護中和實驗的基本步驟

閱讀:665          發布時間:2020-1-3

動物受到病毒感染后,體內產生特異性中和抗體,并與相應的病毒粒子呈現特異性結合,因而阻止病毒對敏感細胞的吸附,或抑制其侵入,使病毒失去感染能力。中和試驗 (Neutralization Test)是以測定病毒的感染力為基礎,以比較病毒受免疫血清中和后的殘存感染力為依據,來判定免疫血清中和病毒的能力。

交叉保護中和步驟

1、將待檢血清用牛血清Hanks 氏液稀釋成1:10,56℃滅活30分鐘;

2、進一步2倍稀釋血清成1:20、1:40、1:80……,對照血清1:10稀釋;

3、稀釋兩種病毒(在冰浴中進行)至含200pfu/ml;

4、各連續稀釋度血清分別與200pfu/ml的兩種病毒液等量混合(各0.3ml),置37℃中作用1小時(每15分鐘振蕩一次);

5、吸出各細胞培養孔中維持液;

6、接種長滿單層的Vero-E6細胞(24孔板),每孔接種血清病毒混合液、標準血清對照及兩種病毒對照 ,每稀釋度兩孔,100ul/孔。37℃吸附1小時,每隔15分鐘搖動一次;

7、加第yi層瓊脂糖覆蓋液(需冷置42℃左右),每孔1ml,室溫下待凝固,細胞面朝上,置37℃5%CO2孵箱培養7-9天;

8、加第二層含中性紅瓊脂糖覆蓋液,1ml/孔,室溫下待凝固,細胞面朝上,置37℃5%CO2孵箱培養2-5天,從第二天開始觀察空斑數;

9、抗體滴度的判定,以比病毒對照的空斑數中和或減少50%的血清zui高稀釋度倒數判為待檢血清中和抗體滴度;

10、交叉保護中和型別判定:根據同一份血清與兩種病毒的反應滴度不同來區分,如果一份血清與漢灘病毒 (或漢城病毒)反應的抗體滴度高于與漢城病毒(漢灘病毒)的抗體滴度4倍或以上,即判為漢灘病毒型,反之則為漢城病毒型。兩者滴度相差無幾時,則不好分型。不足4倍時亦不能定型。

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