化工儀器網
技術文章
Taq酶在聚合酶鏈式反應細節
閱讀：1367 發布時間：2019-3-291976年Chien分離出熱穩定聚合酶，1986年Erlich分離并純化了適于聚合酶鏈式反應的Tq熱穩定性聚合酶，為聚合酶鏈式反應成為實用技術奠定了基礎，現已用基因重組。日前可用于聚合酶鏈式反應的聚合酶有多種：有從水生棲熱菌中提取的Taq酶、從嗜熱棲熱苗中獲得的Taq酶、從Litoralis棲熱球菌中分離的VENT酶、及從酸熱浴硫化裂片苗中分離的Sac酶，而以Taq酶用得廣泛。Taq DNA聚合酶分子量為94kD，75℃時酶比活性為150bs/酶分子，反應溫度過高或過低均影響其延伸率，Taq蕾有很高的耐熱穩定性。豬elisa試劑盒實驗表明，在92.5℃、95℃、97.5℃時，其半衰期分別為40min、30min和5min。
純化的Taq酶在體外無3'-5'外切酶活性，因而無校正閱讀功能，在擴增過程可引起錯配。錯配堿基的數量受溫度、Mg2+濃度和循環次數的影響。通常，30次循環Taq酶的錯配率約為0.25％，高于Klenow酶的錯配率。Taq酶在每一次循環中產生的移碼突變率為1/30000，堿基替換率為1/8000。應用低濃度的dNTP（各20μmol／L）、1.5mmol/L的Mg2+濃度、高于55℃的復性溫度，可提高Taq酶的忠實性，此時的平均錯配率僅為5x10^-6次/（核苷酸*循環）。
Taq酶具有類似于末端轉移酶的TdT的活性，可在新生成的雙鏈產物的3'端加上—個堿基，尤其是dATP容易加上。因此，欲將聚合酶鏈式反應產物克隆到載體上，可以用兩種處理辦法：一是構建dT-載體；二是用Klenow酶將3'端的A去掉，即在聚合酶鏈式反應反應后，先在99℃加熱10min滅活Taq酶，調整Mg2+濃度至5-10mmol/L，加入1-2U Klenow片段，室溫下作用15-20min，3'端的A即被切去，
以往用Taq酶進行聚合酶鏈式反應擴增，一般只能擴增小于400bp的DNA片段，經過對酶的結構與功能的改造，以及聚合酶鏈式反應方法學的改進，現已能擴增20kb以上的DNA分于。
Taq酶在聚合酶鏈式反應反應中加入的量也很重要，太少當然不好，太多一方面浪費，同時也導致非特異性擴增，通常每lOOμl反應液中含1-2.5U Taq酶為好。在0.5-5U范圍內確定佳酶濃度。另一個問題是，雖然Taq酶是熱穩定性較好的工具酶，也應注意在-20℃貯存。