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鴨型乙型肝炎病毒（DHBV）熒光定量PCR檢測試劑盒使用步驟
閱讀：368 發布時間：2019-8-7鴨型乙型肝炎病毒(DHBV)熒光定量PCR檢測試劑盒使用步驟
一、樣品 DNA 的制備
1. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒 DNA 提取試劑盒兼容。
二、稀釋陽性對照（以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例。由于標準品濃度非常高，
因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成
鴨型乙型肝炎病毒(DHBV)熒光定量PCR檢測試劑盒 GE14-44200
分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照， 只提供可以直接使用的長為 86bp 的 DNA 片段作為陽性對照。
2. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4.在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
5.換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
6.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
7.換槍頭，在 4 號管中加 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照到 4 號管中，得 1×10E4 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
8.重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。三、設置 qPCR 反應（20 μL 體系，在樣品制備室進行）
9.在 PCR 管中加入下列成分（待測樣品需要做三次重復，下表只列出一次。樣品管
和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后zui后加）：
成分 樣品 陰性對照 陽性對照（2-7 管）
2×qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各 10 μL
引物混合物 2 μL 2 μL 各 2 μL自備 10×ROX (見注) 2 μL 2 μL 各 2 μL
待測樣品 DNA 模板 6 μL 不加 不加
各 6μL（2 號樣到陽性對照（2-7 號） 不加 不加 2 號管，3 號樣到 3
號管…）
注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用ROX 作為對照，其他熒光 PCR 儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，則用水替代。
10.蓋上蓋子后上機，按下面參數進行 PCR（具體 PCR 參數可以根據儀器不同而自行
優化）。
過程 溫度 時間
預變性 95℃ 1 分鐘
PCR 反應 95℃ 15 秒
（30 個循環） 60℃ 15 秒
72℃ 15 秒
11.數據采集
具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產品中所含的熒光染料在不結合 DNA 時， 大吸收光譜在 471 nm，結合 DNA 時的大吸收光譜在 500 nm，大發射光譜在 530 nm。
四、數據處理
12.以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品
的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
產品保存 低溫運輸，-20℃保存