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CUT&RUN丨CUT&RUN RNA m6A-Seq,操作時間少于1小時

時間:2024/7/17閱讀:120
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N6-甲基腺苷(m6A)是真核生物RNA分子上Z常見和Z豐富的修飾。m6A修飾由甲基轉移酶復合體METTL3催化,并通過m6A RNA去甲基化酶FTOALKBH5去除,這些酶以α-酮戊二酸(α-KG)和Fe2+依賴的方式催化m6A去甲基化。已知METTL3FTOALKBH5在許多生物過程中發揮重要作用,包括發育、代謝和生育。m6A占所有RNA堿基甲基化的80%以上,存在于不同物種中。m6A主要分布在mRNA中,也出現在非編碼RNA中,如tRNA、rRNAsnRNA。m6AmRNA轉錄本中的相對豐度已被證明可以影響RNA代謝過程,如剪接、核輸出、翻譯能力和穩定性以及RNA轉錄。由于m6A RNA甲基化酶和去甲基化酶缺陷引起的m6A甲基化水平異常可能導致RNA功能障礙并引起疾病。例如,由于FTO突變患者中FTO活性增加,通過尚未定義的途徑,目標mRNAm6A水平異常低,有助于肥胖及相關疾病的發生。RNA上動態可逆的化學m6A修飾也可能作為具有深遠生物學意義的新表觀遺傳標記。因此,更多有助于更好理解m6A RNA甲基化水平和分布的有用信息,可以促進疾病的診斷和治療。

目前,有幾種方法用于表觀轉錄組范圍的m6A定位。這些方法包括MeRIP-seq、PA-m6A-seqmiCLIPm6A-CLIP。MeRIP-seq已被廣泛使用,但無法實現m6A分析的高分辨率。PA-m6A-seq、miCLIPm6A-CLIP提高了分析分辨率,但存在可重復性差和過程復雜的問題。特別是,這些方法耗時(>2天)且成本高。

為了解決這些問題,EpigenTek開發了一種新方法:CUT&RUN RNA m6A-Seq(在目標下切割并使用核酸酶回收用于m6A測序)。我們的創新方法結合了MeRIPm6A-CLIP的優勢,具有z快的程序,并將其整合到EpiNext™ CUT&RUN RNA m6A-Seq試劑盒中。

 

艾美捷 EpiNext™ CUT&RUN RNA m6A-Seq試劑盒P-9016特點

1高富集度:使用RNA切割酶混合液同時切割RNA,并在目標m6A含有序列的兩端切割/移除任何RNA序列,而不會影響抗體占據的RNA區域。僅與抗m6A抗體結合的短RNA片段被生成。因此,可以可靠地識別真正的目標m6A富集區域,并實現高分辨率定位。

2、低輸入量:未結合的RNA切割和免疫捕獲在同一個管中進行,這使得目標m6A含有區域得到一定程度的保護,同時Z小化樣本損失,允許輸入RNA低至500納克。

3、Z小背景:在目標m6A含有序列的兩端切割未結合的RNA序列,能夠Z小化MeRIP/測序背景,允許數據分析時讀取數少于1000萬次。

4快速、簡化的程序:從RNAcDNA庫的程序少于6小時,且操作時間少于1小時。

5、高度方便:試劑盒包含CUT&RUN RNA m6A-Seq的每個步驟所需的所有組分,這些組分足以進行m6A含有RNA序列捕獲和捕獲的cDNA庫制備,因此使CUT&RUN RNA m6A-Seq成為Z方便、可靠且結果一致的方法。

 

CUT&RUN RNA m6A-Seq試劑盒檢測原理:

EpiNext™ CUT&RUN RNA m6A-Seq試劑盒包含了從總RNA開始進行成功的m6A-Seq所需的所有必要試劑。在反應中,目標m6A含有區域兩端的RNA序列被切割/移除,并且使用結合有m6A捕獲抗體的珠子捕獲目標m6A含有片段。然后,目標m6A含有的RNA片段被回收、釋放、逆轉錄,并連接接頭。連接后的第一條鏈cDNA被擴增,然后用作文庫合成的模板。使用高保真PCR混合液進行文庫cDNA的擴增和索引。然后使用結合珠子清理cDNA。試劑盒中還包括一個陰性對照非免疫IgG,可以用來展示試劑盒的效果,并在富集RNA定量或生物分析儀分析步驟中展示性能。

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EpiNextCUT&RUN-RNA m6A-Seq試劑盒的工作流程。


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