CUT&RUN（Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease）是一種用于研究?jī)?nèi)源蛋白質(zhì)與DNA相互作用的新技術(shù)。它是在2017年由染色質(zhì)研究領(lǐng)域的大牛Steven Henikoff實(shí)驗(yàn)室發(fā)明的。這個(gè)方法結(jié)合了抗體靶向和原位核酸酶剪切的優(yōu)勢(shì)，提供了一種高效且精準(zhǔn)的方法來(lái)分析染色質(zhì)蛋白結(jié)合位點(diǎn)。 類似于ChIP（chromatin immunoprecipitation），CUT&RUN也是利用抗體靶向染色質(zhì)相關(guān)修飾和蛋白，但其所需細(xì)胞量和測(cè)序深度比傳統(tǒng)ChIP更低。

CUT&RUN實(shí)驗(yàn)可以用來(lái)分析多種蛋白的染色質(zhì)圖譜，包括PTMs，轉(zhuǎn)錄因子，染色質(zhì)remodelers和染色質(zhì)writers/readers。

CUT&RUN原理：

跟ChIP的靶點(diǎn)覆蓋范圍類似，CUT&RUN也適用于研究組蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)修飾酶以及其他DNA結(jié)合蛋白在基因組上的結(jié)合位點(diǎn)。但跟ChIP不同的是，CUT&RUN是通過(guò)抗體靶向和核酸酶原位切割的方法，將目的蛋白結(jié)合的DNA從染色質(zhì)上切割并釋放出來(lái)。CUT&RUN的主要步驟是首先將細(xì)胞通透化，隨后加入目的蛋白抗體特異性的結(jié)合在目的蛋白處，并招募和protein A/G偶聯(lián)的微球菌核酸酶（pA/G-MNase），最后加入Ca2?激活MNase活性，切割目標(biāo)區(qū)域的DNA并回收，用于qPCR檢測(cè)或NGS建庫(kù)測(cè)序。

CUT&RUN實(shí)驗(yàn)流程：

1. 收獲細(xì)胞并和beads結(jié)合：

收獲細(xì)胞，并且進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，推薦起始細(xì)胞數(shù)量5千-50萬(wàn)個(gè)。用室溫的wash buffer對(duì)細(xì)胞清洗兩次后加入ConA beads，室溫下溫柔孵育5-10min，使細(xì)胞結(jié)合在beads上。  

2. 細(xì)胞通透化處理和一抗孵育

在細(xì)胞和beads結(jié)合之后，將管子轉(zhuǎn)移到磁力架上棄去上清，并加入適量抗體結(jié)合buffer重懸beads。按照1:100或者廠家推薦的濃度加入一抗，室溫孵育2h或4℃孵育過(guò)夜。

3. 結(jié)合pA/G-MNase融合蛋白

抗體孵育完成后，將管子轉(zhuǎn)移到磁力架上棄去上清，并加入適當(dāng)清洗溶液清洗2-3次，去除未結(jié)合到目的蛋白上的多余游離抗體。最后一步清洗完成后，用含有pA/G-MNase融合蛋白的溶液重懸ConA beads，孵育時(shí)間最短可以室溫孵育10分鐘，或者可以4℃孵育1個(gè)小時(shí)。這一步是為了使MNase通過(guò)其融合的protein A/G被抗體招募到目的蛋白結(jié)合處。

4. DNA片段化與純化

pA/G-MNase孵育完成后，將管子轉(zhuǎn)移到磁力架上棄去上清，并加入適當(dāng)清洗溶液清洗2-3次，去除沒(méi)有結(jié)合到目的蛋白上的游離pA/G-MNase。最后一步清洗完成后，將管子放置在冰上，加入鈣離子激活結(jié)合到目的蛋白上的pA/G-MNase，使其可以切割目的蛋白結(jié)合的DNA，此步孵育反應(yīng)在冰上進(jìn)行。切割完成后加入反應(yīng)終止液，并在37℃孵育30分鐘，這是為了將被切割的DNA釋放到上清中。隨后將管子轉(zhuǎn)移到磁力架上吸附，小心地將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管子中。這里就是目的蛋白結(jié)合的DNA，隨后進(jìn)行DNA進(jìn)行純化回收。

DNA純化回收后，可以進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，然后送測(cè)序分析。對(duì)于太少的細(xì)胞，Epigentek不太推薦做qPCR，因?yàn)槠鹗技?xì)胞比較少，得到的目的DNA量非常低，qPCR的循環(huán)數(shù)會(huì)非常高。

艾美捷 EpiNext™ CUT&RUN RNA m6A-Seq試劑盒使用指南：

旨在從微量RNA輸入中富集含有m6A的RNA片段，并為使用Illumina平臺(tái)（如Illumina Genome Analyzer II、HiSeq和MiSeq系統(tǒng)）的下一代測(cè)序準(zhǔn)備文庫(kù)。試劑盒的創(chuàng)新工作原理、優(yōu)化的協(xié)議和組分允許以最小的非特異性背景水平捕獲m6A片段。富集的RNA特別適合快速構(gòu)建非條形碼（單重）和條形碼（多重）文庫(kù)，允許以較小的偏差和高分辨率映射m6A區(qū)域。

輸入量： 一般來(lái)說(shuō)，每個(gè)反應(yīng)的總RNA量可以是1微克到20微克。為了最佳準(zhǔn)備，輸入量應(yīng)該是10微克RNA，盡管使用總量低至500納克的RNA也可以獲得CUT&RUN RNA m6A-Seq數(shù)據(jù)。

起始材料： 起始材料可以包括各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞樣本，如來(lái)自培養(yǎng)瓶或板的培養(yǎng)細(xì)胞、從血液、體液和新鮮/冷凍組織中分離的原代細(xì)胞或稀有細(xì)胞群體、從整個(gè)細(xì)胞群體中分選的特定細(xì)胞和胚胎細(xì)胞等。

抗體： 該試劑盒中使用的抗m6A兔多克隆抗體對(duì)m6A RNA片段具有高度特異性，具有MeRIP級(jí)，并且不與未甲基化的腺嘌呤RNA片段發(fā)生交叉反應(yīng)。

內(nèi)部對(duì)照： 該試劑盒提供了一個(gè)陰性對(duì)照非免疫IgG。

注意事項(xiàng)： 為了避免交叉污染，請(qǐng)小心地將樣本或溶液滴入試管中。使用防氣溶膠的移液管頭，并在液體轉(zhuǎn)移之間始終更換移液管頭。在整個(gè)過(guò)程中佩戴手套。如果手套與樣本接觸，請(qǐng)立即更換手套。