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天然腔腸素:深入研究其生物合成過程及再細胞信號傳導中的作用

時間:2024/4/18閱讀:176
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天然腔腸素是海腎熒光素酶(Rluc)和Gaussia熒光素酶(Gluc)等多種熒光素酶的作用底物,也是水母發(fā)光蛋白的輔助因子,應用非常廣泛,可用于檢測活細胞中鈣離子濃度,基因報告分析,BRET(生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移)研究,ELISAHTS,以及組織或細胞中ROS水平的化學發(fā)光檢測。

 

艾美捷天然腔腸素#303參數(shù):

中文別名 天然腔腸素;腔腸素游離酸

英文別名 Renilla luciferin;Coelenterazine free base

分子式 C26H21N3O3

分子量 423.46

外觀 黃色固體

溶解性 溶于甲醇或者乙醇,不可溶于DMSO

純度 97%(TLC)

 

21.png

 

溶液配制:

對于所有進行熒光信號檢測的試驗建議溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。建議可用乙醇或丙二醇配制成儲存液(配制濃度可參考文獻推薦)。在使用時需將儲存液用合適的緩沖液稀釋成工作液。

注意:

1、在用蒸餾水或者PBS及其他的溶液進行腔腸素儲存液的稀釋時需排除稀釋液中的氣泡。同時工作液呈弱酸性,既可以減緩腔腸素的氧化,同時也可防止沉淀的析出。但是弱酸也有可能對后續(xù)熒光強度RLU的檢測造成誤差。

2、腔腸素的工作液不穩(wěn)定,避免過夜保存。

 

注意事項:

1保存時若接觸空氣,時間過久會使得腔腸素氧化,造成實驗結(jié)果的不準確性。

2對于儲存液的制備,較穩(wěn)定的是保存于丙二醇中,同時可加入還原劑如L-抗壞血栓,β-巰基乙醇,DTTDTE(二硫赤糖醇),或少量的鹽酸。還原劑的存在可能會破壞熒光素酶的結(jié)構(gòu),也會影響腔腸素的氧化速率。

3腔腸素在醇類物質(zhì)中的冰凍保存可能會導致沉淀的析出(和濃度有關(guān)),可通過將溶液加熱至5060℃至其溶解。在使用前請確保眼觀無沉淀。

4Z適溶劑的選擇取決于多種因素,如還原劑。對于水母發(fā)光蛋白的檢測,可選用β-巰基乙醇,因為此還原劑能夠使水母發(fā)光蛋白更好地與腔腸素作用。但對于Gluc蛋白的檢測,由于蛋白中含有5對二硫鍵,在還原劑的存在狀態(tài)下不能夠檢測到熒光信號。

5腔腸素在不同溶劑中的溶解特性:(單位:mg/mL

溶劑 室溫 60(Vortex)

Methanol 100% 46 70

Ethanol 100% 64 196

Propanol 100% 82 204

Butanol 100% 86 180

Propylene Glycol 24 240

b-Mercaptoethanol 160 268

注意:

1)腔腸素的丙二醇溶液在室溫下的溶解度較低,但是在-70℃的狀態(tài)下沒有沉淀析出。

2)腔腸素在β-巰基乙醇中的溶解度在室溫和60℃時都是最高的,但能夠穩(wěn)定存在的時間還有待進一步測試。

6、當使用多孔板進行熒光值的檢測時,建議通過設(shè)置對照孔來消除由于腔腸素在工作液中不斷被氧化所帶來的誤差。

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