時間分辨熒光：
理論上，熒光是*靈敏的檢測手段，由于許多分子間和分子內(nèi)的變化會改變標記物的熒光發(fā)射。因此，很早就把它作為均相分析技術可能的新的手段。而現(xiàn)在偏振，淬滅，時間關聯(lián)，熒光壽命改變以及熒光共振能量轉移（FRET）已經(jīng)被廣泛應用在對分子間作用的研究中。
在生物溶液或血清中的很多化合物和蛋白質(zhì)是自發(fā)熒光的，利用傳統(tǒng)的快速熒光基團進行檢測極大的限制了實驗靈敏度。使用長壽命的熒光基團結合時間分辨的檢測方式（在熒光激發(fā)和發(fā)射檢測之間有一個時間延遲）可將快速熒光的干擾降到*低。
時間分辨熒光（TRF）利用稀土元素中鑭系元素的*性質(zhì)。再TRF中常用的鑭系元素是釤（Sm）、銪（Eu）、鋱（Tb）、鏑（Dy）。與傳統(tǒng)熒光基團相比，他們具有大的斯托克位移，和非常長的發(fā)射半衰期（從微妙到毫秒），這使它們在生物學熒光應用領域中日益重要。
通過直接激發(fā)使鑭系元素離子產(chǎn)生熒光是不容易的，因為這些離子很難吸收光子，鑭系元素必須首先與有機分子形成復合物，有機分子收集光子并通過分子內(nèi)非放射性過程轉移到鑭系元素上。稀土元素螯合物和穴狀配合物是能量收集裝置的典型代表，他們收集能量并轉移到鑭系元素離子上，后者則發(fā)出其特征性的長壽命熒光。
為了能夠成功應用于生物學檢測中，稀土元素復合物應該具有特定的性質(zhì)，包括穩(wěn)定性。較高的發(fā)射光產(chǎn)率，并且能夠與生物分子進行連接。除此之外，當直接在生物溶液中進行反應時，能夠耐受熒光淬滅就顯得尤為重要。稀土元素螯合物穩(wěn)定性較差，而且有的化合物可競爭螯合物活性基團，當與FRET技術結合在一起時其靈敏度也會收到限制。如果稀土元素與穴狀物結合，許多限制因素都可去除。

熒光共振能量轉移（FRET）：
熒光共振能量轉移是指在兩個不同的熒光基團中，如果一個熒光基團(供體 Donor)的發(fā)射光譜與另一個基團(受體 Acceptor)的吸收光譜有一定的重疊，當這兩個熒光基團間的距離合適時(一般小于100Å)，就可觀察到熒光能量由供體向受體轉移的現(xiàn)象，即以前一種基團的激發(fā)波長激發(fā)時，可觀察到后一個基團發(fā)射的熒光。

在熒光共振能量轉移中，受體發(fā)射熒光的壽命等同于供體的發(fā)射熒光的壽命。因為Eu的熒光衰減周期較長，所以含Eu的供體會誘導XL665受體長時間地發(fā)射熒光，受體激發(fā)后產(chǎn)生的熒光便能持續(xù)較長時間，這樣通過時間分辨就可以區(qū)分那些短壽命的自身散射的熒光，這樣從短壽命熒光背景中就很容易區(qū)分出FRET信號。
當由于生物分子相互作用導致兩個熒光基團接近時，在激發(fā)時被穴狀化合物捕獲的部分能量釋放，發(fā)射波長為620nm；另一部分能量轉移到受體（acceptor）上，發(fā)射波長為 665nm。665nm的發(fā)射光僅僅由供體（donor）引起的FRET產(chǎn)生。所以，當生物分子相互作用時，有兩個激發(fā)光620nm和 665nm；當不存在相互作用時，只有620nm一個激發(fā)光。
trFluor 鏈霉親和素綴合物，這種綴合物通常與生物素化的二抗結合使用，可作為間接免yi熒光染色的第二檢測試劑。同時它們是利用TR-FRET平臺進行生物素-鏈霉親和素的生物學測定非常有價值的工具，trFluor 鏈霉親和素偶聯(lián)物由trFluor和鏈霉親和素組成，trFluor Eu或trFluor Tb共價附有時間分辨的紅色熒光euro（Eu）標記或綠色熒光ter（Tb）標記。
時間分辨發(fā)光探針的典型受體：
1。trFluor Eu琥珀酰SE；貨號：AAT-1433
2。trFluor Tb馬來酰亞胺；貨號：AAT-1444
3。別藻藍蛋白APC；貨號：AAT-2554
trFluor 染料的主要特點：
1.無需添加氟化物或增強溶液。
2.適用于多種反應形式。
3.比其他TRF染料更容易與生物分子偶聯(lián)，具有更高的偶聯(lián)產(chǎn)率。
4.在?350 nm處被普通光源*大程度地激發(fā)。

使用trFluor 標記的鏈霉親和素偶聯(lián)物進行TR-FRET測定原理