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SPET技術助力歐盟茄科種質庫的基因分型
G2P-SOL項目是一個歐盟資助的茄科作物項目，匯集了歐洲和國際上主要的種質庫，其中包括馬鈴薯、番茄、胡椒和茄子這四種主要茄科作物的種質資源。在該項目中，已對包括野生近緣種在內的約 5,900 個茄子種質進行了收集。 為了獲得約 3,500 個代表性種質的基因組信息，該項目設計了一組定制的 5K SNP位點的SPET 技術探針（單引物富集技術，Nugen），這些SNP位點均勻分布在整個基因組，并且SNP位點主要位于基因豐富的區域。 DNA 樣本由基因庫提供，而文庫制備和 illumina 高通量基因測序由 IGA Technology 公司提供服務。測序數據經質量過濾后，使用 BWA-MEM 將reads與茄子參考基因組序列（4.1 版）比對，并使用 GATK-4.1.9軟件進行 SNP 分析。通過刪除具有低覆蓋測序數據的種質，保留了 3,412 個，并通過應用嚴格的質量標準確定了 120K 多態位點。其中，4306個多態位點為5K SPET探針組靶向的SNP，其余為輔助脫靶SNP。 這些確認的SNP位點為為識別錯誤標記的種質（即錯誤的物種識別）和基因庫內及不同基因庫之間的重復的物種記錄提供了重要信息。此外，SPET技術可用于建立篩選實驗流程以避免不同地域進行重復的種質資源保護。 研究茄子種質間的種群結構和遺傳關系可為全基因組關聯分析（Genome wide association study，GWAS）建立核心種質庫。此外，基于基因庫中可用的歷史表型數據，可確定與關鍵性狀相關的位點。 實驗結果表明，SPET 技術可作為簡化基因組測序和基因芯片的替代方法，是一種可適用于高通量基因分型、管理和增強基因庫收藏的有效工具。
SPET 技術背景介紹：
單核苷酸多態性 (SNP) 是真核生物基因組中豐富的序列變異類型，并且已成為廣泛使用的基因分型標記。 基因分型方法依賴于不同的技術，包括高通量測序NGS、基因芯片和聚合酶鏈式反應 (PCR)。目前，常用的高通量 SNP 發現和基因分型方法是基于簡化基因組測序 (RRS)手段的高通量基因分型測序(GBS，Genotyping by Sequencing)方法，其中大多數是基于限制性內切酶的使用來片段化基因組，通過對這些酶切DNA序列來測序來替代全基因組測序，從而達到基因分型目的。 GBS技術的一個主要限制是限制酶位點并不是在基因組上隨機分布的，因此無法在基因內靶向定位或定位在具有功能意義的分子標記。
Nugen公司（現Tecan Genomics公司）開發了單引物富集技術，這是一種可定制的靶向測序的解決方案，且經濟實惠。 SPET技術通過已有的參考基因組或轉錄組信息以及需要驗證的靶向SNP組來進行探針設計。 SPET 探針長約 40bp，探針設計為與包含SNP的相鄰DNA序列，因此能夠檢測目標SNP并發現目標周圍其他的SNP。SPET最初是應用于醫學領域，多篇Nature文獻都有報道。由于單引物富集相對于PCR引物設計具有更高的靈活性，2019年Scaglione等人在歐盟的項目中把該技術應用在植物分子育種的研究中，評估了SPET技術對玉米和黑楊的基因分型應用。SPET同樣可應用于種質集的基因分型。外顯子的保守序列應有助于在這些區域上設計的 SPET 探針來研究不同相關物種之間的雜交，從而提高發現新 SNP 的機會，特別是如果探針下游區域位于保守性較低的區域，如內含子和非翻譯區域 UTR。
