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　　激光共焦顯微鏡（Laser Confocal Scanning Microscope，LCSM）是生命科學(xué)研究中使用最為廣泛的成像儀器，以下是對其操作與維護(hù)的詳細(xì)指導(dǎo)：

　　操作步驟

　　1.樣品制備：根據(jù)實驗要求制備樣品，樣品制備對成像結(jié)果有著直接影響。樣品類型很多，包括細(xì)胞、組織切片、微生物、植物以及材料，樣品形式可以是固體也可以是液體。樣品制備好后需要放在耗材上才能在顯微鏡系統(tǒng)下觀察，耗材一般有玻片、細(xì)胞爬片、共聚焦小皿以及多孔板等。使用20倍及以上物鏡時，蓋玻片厚度應(yīng)≤0.17mm，或者專用共聚焦小皿底厚33mm。此外，要注意：

　　激發(fā)波長和發(fā)射波長需與儀器配備的激光系統(tǒng)和掃描系統(tǒng)的光譜匹配，以確保最佳成像效果。

　　多色成像時，避免選擇波長接近或有交叉重疊的染料，以防止串色。

　　免疫熒光染色操作步驟復(fù)雜，對科研人員的手法要求嚴(yán)格，在對細(xì)胞或組織進(jìn)行免疫熒光染色時，要注意封閉以及固定的方法，封閉一般使用脫脂牛奶，而固定一般使用甲醇或多聚甲醛；封片時可以加入抗淬滅劑來減弱淬滅。

　　2.開啟儀器：先開啟顯微鏡和激光器，再啟動計算機(jī)，然后啟動操作軟件，設(shè)置熒光樣品的激發(fā)光波長，選擇相應(yīng)的濾光鏡組塊，以便光電倍增管（PMT）檢測器能得到足夠的信號結(jié)果。

　　3.設(shè)置掃描方式：在目視模式下調(diào)整所用物鏡放大倍數(shù)，在熒光顯微鏡下找到需要檢測的細(xì)胞。切換到掃描模式，調(diào)整雙孔針和激光強(qiáng)度參數(shù)，即可得到清晰的共聚焦圖像。使用顯微鏡時，一般從低倍鏡開始找視野，找到視野后再切換高倍鏡觀察。根據(jù)樣品大小及放大倍數(shù)選擇合適物鏡，使成像更清晰，通常情況下，物鏡放大倍數(shù)越高，成像視野越小。

　　4.獲取圖像：選擇合適的圖像分辨率，將樣品完整掃描后，保存圖像結(jié)果即可。

　　5.獲取三維圖像：激光掃描共聚焦顯微鏡具有細(xì)胞“CT”功能，在不損傷細(xì)胞的情況下，可以獲得一系列光學(xué)切片圖像。選用“Z-Stack”模式，開啟選項后確定光學(xué)切片的位置及層數(shù)，再啟動“Start”，即可獲得三維圖像。

　　6.獲取時間序列圖像：共聚焦顯微鏡的“Time-Series”功能可以自動在實驗者規(guī)定的時間內(nèi)按照設(shè)定的時間間隔獲取圖像。只需設(shè)定所需的時間間隔以及所需圖像數(shù)量，開啟“Start T”功能鍵，即可進(jìn)行實驗。

　　7.關(guān)閉儀器：激光共焦顯微鏡測定樣品結(jié)束后，先關(guān)閉激光器部分，計算機(jī)仍可繼續(xù)進(jìn)行圖像和數(shù)據(jù)處理。若要退出整個激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)，則應(yīng)在激光器關(guān)閉后，待其冷卻至少10分鐘后再關(guān)閉計算機(jī)及總開關(guān)。
 

　　維護(hù)方法

　　1.環(huán)境要求：

　　儀器需有專門的實驗室安放，做到干凈、干燥、防震。

　　室內(nèi)安裝空調(diào)和除濕機(jī)，溫度恒定在21℃±1℃（或5~25℃），濕度≤60%，避免陽光直射。

　　儀器周圍要遠(yuǎn)離電磁輻射源，環(huán)境無震動、無強(qiáng)烈的空氣擾動。

　　室內(nèi)具有遮光系統(tǒng)，保證熒光樣品不會被外源光漂白。

　　工作人員出入儀器房要換鞋、換實驗服。

　　2.開關(guān)機(jī)與預(yù)熱：注意開機(jī)關(guān)機(jī)的順序及激光管的保護(hù)，使用需預(yù)熱約半小時，用完機(jī)器一定要等風(fēng)扇停止運(yùn)轉(zhuǎn)再關(guān)機(jī)。

　　3.日常清潔：使用完畢后蓋好防塵罩，并做好儀器表面及內(nèi)部（如光學(xué)部件和機(jī)械部件）的清潔工作。光學(xué)部件包括物鏡表面、目鏡的上表面、聚光鏡、底座光源出口、目鏡筒內(nèi)側(cè)等；機(jī)械部件包括主機(jī)架、載物臺。

　　4.存放與防潮：顯微鏡要經(jīng)常使用，長期不用應(yīng)將主要光學(xué)部件放進(jìn)防潮缸，潮濕地區(qū)的顯微鏡應(yīng)安放防霉片。

　　5.數(shù)據(jù)安全：掃描后的圖像及數(shù)據(jù)嚴(yán)禁用軟盤拷貝，以防病毒浸染激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)。

　　通過以上操作和維護(hù)步驟，可以確保激光共焦顯微鏡的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，從而獲取高質(zhì)量的成像結(jié)果。