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293T細胞在培養的過程中的特別注意事項有哪些?

閱讀:1831      發布時間:2024-6-27
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 HEK-293T細胞是293T(293tsA1609neo)細胞系(ATCC CRL-11268)的衍生物。細胞持續表達SV40抗原,該細胞常用于轉染實驗,轉染效率較高。(轉染一般以50%密度鋪板,待細胞剛剛貼到皿壁上后(一般8-10小時),即可進行轉染操作)

293T細胞的培養條件除了用DMEM(推薦iCell-0001)培養基;胎牛血清,10%;還要添加L-谷氨酰胺(2mM)1%;NEAA  1% ; 雙抗 1%等添加物,但是293T細胞在培養的過程中貼壁能力較弱,在培養過程中特別要注意:

先,293T細胞貼壁能力較弱,培養時可酌情使用預鋪0.2%明膠的培養瓶/培養皿。wan全培養液中需添加熱滅活胎牛血清。細胞生長不能過密,過密細胞容易脫落,脫落下來的細胞可以通過離心收集,使用0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA 消化后繼續培養。

其次,如果發生293T細胞不貼壁,漂浮在培養基中的現象,請確認所使用的DMEM中碳酸氫鈉濃度及培養箱中CO2濃度。并參考以下培養體系:

a) DMEM由1.5 g/L碳酸氫鈉配制而成,使用5%CO2培養箱。

b) DMEM由3.7 g/L碳酸氫鈉配制而成,使用10%CO2培養箱。

當使用碳酸氫鈉含量高的培養基時,必須將這些細胞在10%CO2中孵育,以便正確緩沖培養基。當培養基沒有適當緩沖時,239T細胞雖然可以存活,但將無法粘附并保持漂浮在培養基中。

293T細胞為懸浮和輕微的貼壁細胞,傳代可以參考以下方法:

1. 收集:將培養瓶中的懸浮的細胞收集到離心管中。用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。由于細胞貼壁不牢PBS潤洗后細胞會脫落所以PBS也要回收到離心管中。

2. 加入0.25%(w / v)胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養瓶中(T25瓶1-2mL,T75瓶2-3mL)置于37℃培養箱中消化1-2分鐘(難消化的細胞可以適當延長消化時間),然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,若細胞大部分變圓并脫落迅速拿回操作臺,輕敲幾下培養瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養基來終止消化。

3. 將收集到的懸浮細胞、pbs清洗液中的細胞和消化下來的貼壁細胞以1000rpml離心5min,棄去上清,補加1-2mL培養液后重懸混勻后將細胞懸液按1:2的比例分到新T25瓶中,添加6-8ml按照說明書要求配置的新的wan全培養基以保持細胞的生長活力,后續傳代根據實際情況按1:2~1:5的比例進行。

 

3) 細胞凍存: 收到細胞后建議在培養3代時凍存一批細胞種子以備后續實驗使用。

293T細胞參考文獻:

【1】Ding L, Zeng Q, Wu J, et al. Caveolin1 regulates oxidative stressinduced senescence in nucleus pulposus cells primarily via the p53/p21 signaling pathway in vitro[J]. Molecular Medicine Reports, 2017, 16(6): 9521-9527.

 

【2】邱進, 劉輝, 袁芳, 等. MEF2C 基因啟動子區堿基突變對轉錄活性的影響[J]. 新疆醫科大學學報, 2017, 40(5): 606-611.

【3】Geng F, Lu G F, Ji M H, et al. MicroRNA-26b-3p/ANTXR1 signaling modulates proliferation, migration, and apoptosis of glioma[J]. American journal of translational research, 2019, 11(12): 7568.


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