化工儀器網
技術文章
實時熒光定量PCR是什么？
閱讀：266 發布時間：2024-5-30實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環后產物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。
實時熒光定量PCR工作原理：此次介紹熒光染料法，目前常用的熒光染料是SYBR Green I，是一種結合于所有dsDNA雙螺旋小溝區域的具有綠色激發波長的染料，在游離狀態下，SYBR Green I發出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結合后，熒光大大增強。因此SYBR Green I的熒光信號強度與雙鏈DNA的數量相關，可以根據熒光信號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數量。
在學習實時定量PCR數據處理之前，我們首先需要了解一下它的數學原理，Ct值為什么是我們數據處理過程中的一個關鍵的因素。這兩個圖顯示的是實時定量PCR的一組結果。上圖是原始的線性圖譜，下圖則是處理過的指數圖譜，但是它們兩者表示的是同樣的意思。x-軸表示PCR 循環數，y-軸表示擴增反應的熒光值，也就是擴增產物的量。這個圖中有基線、閾值、Ct值這幾個概念，從這幾個值我們能夠最終得到模板中目的基因的含量。
（1）那么什么是基線？如紅色框所指，基線就是擴增曲線中的水平部分。在反應最初階段，雖然產物是指數級增長，但是由于總量太少，其熒光處于背景水平，檢測不到熒光增加。因此基線信號的產生是由于測量的偶然誤差引起的。然而當累積了足夠的擴增產物，足以產生可檢測的熒光信號時，這個信號的值就被稱為閾值，如紅色箭頭所指。通常閾值默認為基線信號的標準偏差×10。在閾值的前后，PCR的反應仍然是指數級增長的，因此此時的PCR結果可靠，可以準確地反映體系中模板的初始量。Ct值是信號強度達到閾值時所需要的循環數，也就是擴增曲線與閾值的交叉點，如圖中的紅點所指。
（2）我們可以看到圖的右邊顯示了擴增曲線的4個階段：基線期、指數增長期、線性增長期和平臺期。其中在基線期和指數增長期，擴增產物都是以指數級增長的，但是在基線期我們沒有辦法檢測；而到了線性期和平臺期之后，由于不同基因，或者不同條件下其擴增效率差別很大，因此沒有辦法計算模板的含量。因此，在指數增長期的Ct值就成為了計算模板含量的一個關鍵值。
（3）那么，為什么知道了Ct值就能夠得到最初的目的基因含量呢？圖中表示一個基因的單次反應擴增曲線。上面這個公式計算的是擴增產物的分子數N，它等于模板的分子數乘以1+擴增效率的n次方，n代表循環次數。也就是說，如果擴增效率為100%，產物分子數就等于模板數乘以2的n次方。但是顯然，在線性增長期和平臺期，擴增效率不可能是100%，因此上述PCR理論方程只在指數期成立，也就是綠色框的部分。