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免疫印跡（immunoblotting）又稱蛋白質印跡（Western blotting），是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發展起來的一種新的免疫生化技術。由于免疫印跡具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現已成為蛋白分析的一種常規技術。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進行定性和半定量分析 。結合化學發光檢測，可以同時比較多個樣品同種蛋白的表達量差異。

WB檢測之內參抗體

Western Blot檢測方法不僅能檢測靶蛋白存在與否， 還能比較不同條件下或者不同組織中靶蛋白的相對表達量，可作為蛋白表達水平最直接的證據。在WB實驗中有眾多不確定因素影響靶蛋白表達水平的測定，如方法學本身性質、操作誤差等。為準確衡量靶蛋白表達水平，需要精確一致的上樣量，使用內參的意義即是保證上樣量的一致。內參即內部參 照(Internal Control) ， 對哺乳動物細胞一般指管家基因的表達蛋白(Housekeeping Proteins) 。此類蛋白在各組織和細胞中的表達相對恒定， 可作為檢測蛋白表達水平變化的參照物。當內參條帶亮度基本一致時，基本可以確定上樣量是一致的，通常采用比較靶蛋白和內參蛋白條帶亮度比值來進行相對定量。

WB實驗中涉及到的蛋白-抗體結合是一個復雜的活性生物大分子間的相互作用，眾多因素都會影響實驗的結果。例如時間、溫度、濃度、離子強度等。

內參使用方法

1.標記內參：酶標的內參抗體可避免二抗結合總蛋白中某些免疫球蛋白產生的雜帶，使用時只需在二抗孵育時加入酶標內參抗體，按照正常操作即可。

2.普通內參：當靶蛋白分子量與所選內參分子量相差不大時，可先對靶蛋白進行顯色檢測， 然后用Strip緩沖液洗掉膜上抗體， 重新對內參蛋白進行顯色檢測。當靶蛋白分子量與所選內參分子量相差較明顯時，可對轉膜預染，根據蛋白質分子量將膜剪為兩部分并分開進行靶蛋白和內參蛋白的顯色檢測。內參抗體選擇常用的蛋白內參有GAPDH和β-actin或β-tubulin， 內參的選擇原則是選擇與靶蛋白分子量相差5KD以上的內參，對不同的樣本則需要根據實際情況進行選擇。

1.根據物種選擇

哺乳動物來源的組織或細胞樣本通常選擇β-actin、 β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H 3、Na'/K'-ATPase等。植物來源的樣本常選擇plant actin、Rubisco等。對于其他研究稀少的物種可參考報導的文獻進行選擇。以GAPDH為例， 抗GAPDH單抗(ABGENT， clone6C 5) 能夠與非洲蟾蜍、猴、豬、羊、狗、貓、魚、蛙、雞、兔、小鼠、大鼠及人組織來源的GAPDH反應， 但不能與酵母GAPDH反應。

2根據組織類型選擇

以肌動蛋白actin為例， 肌動蛋白actin在不同物種之間高度保守， 且同一物種類型actin的序列相似性大于90%， 使其很難獲得特異性較好的抗actin抗血清。但物種不同類型actin的N段序列相似性僅50~60%， 故Ｎ端序列常被用來制備抗actin體。脊椎動物肌動蛋白分為α、 β和y三種類型， a型分布于心肌、橫紋肌細胞利肌細胞中， y型分布于平滑肌細胞和非肌細胞中，β型分布于非肌細胞中，共六種蛋白， 不同廠商生產抗B-actin抗體過程中選擇的免疫區段在不同型actin之間的否影響到抗體的組織特異性。選用β-act inN端的16個氨基酸序列制備的單多抗占數， 這類抗體均不能檢測心肌和橫紋肌中的actin條帶。選用β-act inC端16個氨序列制備的抗體則可以在肌肉細胞中檢測到actin的信號。

3.根據蛋白組分選擇

提取細胞蛋白組分過程中，胞漿蛋白通常是最先提取出來的。離心全細胞裂解液的上清含胞漿蛋白，而沉淀含胞核蛋白和胞膜蛋白，繼續加大裂解程度即可提取到胞白，最后才能提取到胞膜蛋白。通過特殊的方法還可以從胞漿蛋白中提取到線粒體蛋葉綠體蛋白等。針對不同的細胞組分需要選擇不同的內參抗體。

在選擇細胞總蛋門內參時.GAPDH、P-actin, tubulin^種內參冋時發生變化的情況 很少，如出現這種情況.可用胞核內參戻至線粒體內參代替。另外.不同的實驗冃的應選 樣不同的內參，例如檢驗質核分離效果應選擇胞漿蛋白內參actin.抽提的核組分中檢測 不到actin則表示質核分離效果較好。

總之,內參的選擇要根據實際情況而定.不僅要考慮到物種、組織、組分等因素。還需要考慮到實際的實驗設計。如實驗設計中包括組織缺氧、糖尿病等因素變量.則不適宜選擇GAPDH作內參，研究細胞增殖的相關實驗中則不適宜選c-Jun作內參.在凋亡實驗中則要避免使用TBP、Lamin等。