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熒光激活的細胞分類儀檢測調亡細胞
閱讀：182 發布時間：2017-7-18| 提 供 商 | 上海谷研實業有限公司 | 資料大小 | 28.9KB |
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| 資料類型 | JPG 圖片 | 瀏覽次數 | 182次 |
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一、轉化細胞原位缺口翻譯檢測裂解的dna片段
1．取106經促調亡物質處理的細胞，用1％ BSA-PBS洗滌細胞后加入0.1ml FITC標記的抗CD4或抗CD8單克隆抗體，4℃ 20分鐘。用1％ BSA-PBS洗滌細胞。置冰上。
2．加入0.1ml 1％多聚甲醛，置冰上5分鐘，加入60％（v/v）甲醇溶液，輕輕懸浮細胞，4℃固定細胞15分鐘。4℃離心500×g 10分鐘，去上清液。
3．加入0.1ml 0.1％ Triton X-100，4℃15分鐘。用1％ BSA-PBS洗滌細胞2次。加入50μl缺口翻譯緩沖液（50mmol/L Tris-HCl pH7.4，5mmol/L MgCl2, 1.5U大腸桿菌DNA多聚酶I，50nmol/L 生物素-14-dUTP，50nmol/L dATP, 50nmol/L dGTP, 50nmol/L dCTP），37℃反應60分鐘。用冷PBS洗滌細胞2次，懸浮于0.1ml預冷的1％ BSA-PBS中。
4．加入10μl抗生素蛋白-PE，4℃ 30分鐘，用冷PBS洗滌細胞。
5．上樣于FACS儀，用FACScan LysisⅡ軟件分析。可以同時了解調亡細胞的類型。
二、末端脫氧核苷酸轉移酶檢測法檢測裂解的DNA片段
1．在37℃，含10％小牛血清的RPMI-1640培養液中，用促調亡物質喜樹堿處理人PBMC 4小時。或用10－5g/ml地塞米松處理小鼠胸腺細胞4小時。
2．取106經處理的細胞，用1％ BSA-PBS洗滌細胞后加入0.1ml FITC標記的抗CD或抗CD8單克隆抗體，4℃ 20分鐘。用冷1％ BSA-PBS洗滌細胞2次。置冰上，加入0.1ml 1％多聚甲醛，4℃ 15分鐘。用冷PBS洗滌細胞2次，加入冷70％（v/v）乙醇溶液，輕輕懸浮細胞，－20℃固定細胞24小時。4℃離心500×g 10分鐘，去上清液。
3．用PBS洗滌細胞2次。加入50μl TdT反應液懸浮細胞，37℃反應30分鐘。用PBS洗滌細胞2次，懸浮于0.1ml PBS中。
4．加入10μl抗生物素蛋白-TC或抗生物素蛋白-FITC，室溫反應30分鐘，用PBS洗滌細胞。
5．上樣于FACS儀，分析調亡細胞的類型和調亡情況。
三、7-AAD染色法
1．取5×105經不同處理的細胞，用PBS洗滌細胞1次，加入10倍量PBS，離心500×g 5分鐘，去上清液。
2．用0.5ml含20μg/ml 7-ADD的PBS懸浮細胞，4℃避光放置20分鐘。
3．轉化細胞直接在FACS上用650nm濾光片檢測紅色熒光，用Lysis Ⅱ軟件分析，可區分活細胞（R1）、早期調亡的細胞（R2）和后期調亡細胞/死細胞（R3）。
四、PI染色法
1．取2.5×105～3.5×105經不同處理的細胞，接種在24孔細胞培養板的各孔中，在37℃ 5％ CO2飽和水汽二氧化碳培養箱中培養24～48小時。
2．每孔加50ml 100mg/ml PI。直接在FACS上用FL2濾光片檢測紅色熒光，用Lysis Ⅱ軟件分析，可區分活細胞（R1，不著染）和死細胞（R2，著染）。
五、Annexin V、7-AAD（或PI）聯合染色法
1．配制10倍濃縮的結合緩沖液：含140mmol/L NaCl, 25mmol/L CaCl2的0.1mol/L pH 7.0 Hepes/NaOH緩沖液，4℃保存，用前用雙蒸水稀釋10倍。
2．用預冷的PBS洗滌經不同處理的待測細胞，洗2次。用結合緩沖液將細胞配制1×106/ml。取0.1ml細胞懸液置5ml培養管中。
3．
加入5μl AV-FITC，再加5μl 7-ADD或10μl PI。稍稍混懸細胞，置暗處，室溫（20～25℃）15分鐘。
4．立即加入0.4ml結合緩沖液，終止反應。立即在FACS上分析。注意設立對照：未經處理的細胞對照，排除自發調亡；不加染色劑的對照；只加AV的對照；只加7-ADD或PI的對照等。
六、轉化細胞溴乙啶/吖啶橙染色法