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游離細(xì)胞藥物攝取實驗操作說明
閱讀：5995 發(fā)布時間：2017-3-16| 提 供 商 | 上海谷研實業(yè)有限公司 | 資料大小 | 7.9KB |
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原理和目的
游離細(xì)胞攝取實驗以大鼠游離肝細(xì)胞、人游離肝細(xì)胞應(yīng)用較為廣泛。肝細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)運體主要為有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽(organic anion transporting polypeptides,OATPs)、Na+-牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運多肽( Na+/taurocholate cotransporting polypeptide, NTCP)、有機陰離子轉(zhuǎn)運體（organicanion transporters, OATS )、有機陽離子轉(zhuǎn)運體（organic cation transporters, OCTs）等，這些轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)藥物在體內(nèi)的肝臟分布及膽汁排泄過程。
應(yīng)用膠原酶灌流法分離大鼠肝細(xì)胞并取得有較高活性的游離肝細(xì)胞（或者人的肝細(xì)胞），考察肝細(xì)胞對藥物的攝取動力學(xué)特征，求出有關(guān)動力學(xué)參數(shù)，以研究存在于肝細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)藥物轉(zhuǎn)運的機制。
本實驗方法的優(yōu)點是可以靈活地控制實驗條件，但是會使游離肝細(xì)胞失去了細(xì)胞極性（即方向性，如血管側(cè)和膽管側(cè)）?？梢酝ㄟ^使游離肝細(xì)胞與藥物在一定條件下、一定時間接觸后測定肝細(xì)胞攝取藥物的經(jīng)時曲線，求出肝清除率，并可定量預(yù)測藥物在肝臟的分布及膽汁排泄。
材料
1．大鼠或者人肝細(xì)胞混懸液若干。
2．試劑 0.4％錐蟲藍(lán)、待測藥物溶液、混合油（礦物油37.4g、硅油6.88g),Krebs-Hens-eleit 液（118mM NaCl，23.8mM NaHC03，4.8mM KCl，1.OmM KH2PO4，1.2mM MgSO4，12.5mM HEPES,5.OmM glucose，and 1.5mM CaCl2，調(diào)節(jié)pH 7.4）
3．儀器及試劑凈化工作臺、倒置顯微鏡、恒溫水浴振蕩培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機、制冰機、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。
方法
1．用膠原酶灌流的方法分離肝細(xì)胞并取得有較高活性的游離肝細(xì)胞置于冰上，在計數(shù)后將其稀釋成2x106/ml的懸濁液。
2．取其一部分放置于37℃恒溫水浴振蕩培養(yǎng)箱，溫孵3分鐘后，加入等體積待測藥物，在37℃的恒溫振蕩條件下開始進(jìn)行游離肝細(xì)胞對藥物的攝取實驗。
3．按所需時間點取出一定體積（一般為100ul）藥物及肝細(xì)胞混合液，加到事先準(zhǔn)備的細(xì)離心管中（0.45 ml)，離心管上、下層分別放入100ul混合油（礦物油、硅油）和5M醋酸銨溶液（圖11-1）。
4．立即將有混合藥液的細(xì)離心管離心，使肝細(xì)胞因重力作用從上層藥物的混合液中落入下層的醋酸銨中，從而終止攝取反應(yīng)的進(jìn)行。
5．將終止反應(yīng)后的細(xì)離心管放于-20℃保存，在測定前從混合油層將其切開，經(jīng)沉淀蛋白等處理后用LC-MS進(jìn)行定量測定。
結(jié)果與分析
1．確定藥物的線性攝取時間（溫孵時間）根據(jù)LC-MS定量測定結(jié)果計算各時間點細(xì)胞對藥物的攝取量，作細(xì)胞對藥物攝取量隨時間變化曲線，從而確定線性攝取時間（圖11-2）。
2．濃度依賴性攝取 根據(jù)確定的線性攝取時間，分別進(jìn)行在37℃和4℃下的藥物濃度依賴性攝取實驗，了解藥物的特異性攝?。?7℃）和非特異性攝取（4℃）攝取以及飽和濃度；作細(xì)胞對藥物攝取速度隨藥物濃度變化曲線（圖11-3)。
3．細(xì)胞攝取藥物動力學(xué)參數(shù) 根據(jù)濃度依賴性攝取結(jié)果，由Eadie-Hofstee方程以特異性攝取初速度（υ）對初速度與藥物濃度比值（υ/s）計算Km、Vmax,表征藥物攝取的動力學(xué)特征（圖11-4)。
注意事項
1．待攝取藥物溶液中若含有DMSO，則其含量不能超過 0.1％～0.5%，因為DMSO可能會影響肝細(xì)胞攝取活性。
2．肝細(xì)胞活性鑒定用膠原酶灌流法獲取的游離肝細(xì)胞，在藥物攝取實驗之前用0.4％錐蟲藍(lán)顯微鏡下觀察其活性，活性大于85％可用于攝取實驗。人冷凍肝細(xì)胞活性若不符合要求，可經(jīng)離心純化，直到符合要求后再應(yīng)用。