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技術(shù)文章

解析轉(zhuǎn)化細胞培養(yǎng)方法

閱讀:810          發(fā)布時間:2017-8-29

轉(zhuǎn)化細胞比乳鼠心肌難養(yǎng),用無血清培養(yǎng)基,呈桿狀,橫紋清楚,在培養(yǎng)基里細胞不搏動。
大鼠心肌細胞分離一般是采用二型膠原酶分離,濃度為1mg/ml(用無鈣臺氏液配制),同時酶液里加入牛磺酸,BSA。一般采用Langendorff灌流的方法,大鼠開胸后,迅速取出心臟,放入冰的臺氏液中,找到主動脈后,掛上Langendorff裝置,衡流泵灌入無鈣臺氏液(37度),開始心臟會搏動幾下,這樣把心臟中的淤血擠出(此處也有人用有鈣臺氏液灌流,好讓心臟充分搏動,把淤血擠出,不過我們摸索發(fā)現(xiàn)只要取心臟到掛上去的時間短,一般搏動幾下就能把淤血清楚干凈了)。幾分鐘后,換酶液開始灌流心臟,一般開始時,心臟較軟,待消化一段時間后變硬,繼續(xù)消化后又變軟,且心臟發(fā)白,這時候就可以停止消化,將心室剪下,放入KB液中,用剪刀剪碎后,用滴管吹打,取上清,繼續(xù)加入KB液,吹打,直到上清液不渾濁為止,一般吹打3-4次即可。將各次上清合并,吹打過濾后,沉降20分鐘左右,棄上清,加入無血清培養(yǎng)基(MEM,不含L-谷氨酰胺,并加入肌酸,牛磺酸,BSA,肉毒堿,HEPES),吹打,1000轉(zhuǎn)/分離心半分鐘,棄上清,再洗1-2次后,將沉淀加入到6%的BSA中沉降15-20分鐘(純化心肌細胞),然后計數(shù),點板或培養(yǎng)。
此法中如果各步注意無菌操作,zui后先用加倍雙抗的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后,再換正常培養(yǎng)基,可適用于條件不是很好的試驗室。如果能在板或瓶內(nèi)加入Laminin處理后,貼壁很好。如果分離出來的心肌細胞,逐級復(fù)鈣后培養(yǎng),狀態(tài)更好。*狀態(tài)此中方法能培養(yǎng)7天以上。
膠原酶對膠原的消化作用強,它僅對細胞間質(zhì)有消化作用而對細胞沒有影響,可使上皮細胞和膠原成分分離而不受損害,相反,胰酶作用時間長會對對細胞產(chǎn)生破壞作用。因此我覺得你的細胞狀態(tài)不好可能不是膠原酶的原因。我也在養(yǎng)心肌細胞,消過程中也會有你說的蛋清一樣的狀態(tài),但沒有是整個上清都是的情況,可能正如青山兄所說是你的胰酶放得太少了,5只老鼠可以放3ml的胰酶,我聽師兄說這種蛋清樣的東東含的細胞zui多,所以要劑量把它吸出來,另外我認為吸的時候切勿把組織塊吸上來,我試過吸的組織塊過多,離心后組織快都還飄在懸液中,一倒就把牽有轉(zhuǎn)化細胞的組織塊一塊到走了,到zui后所得的細胞就少很多。
先擠一會再剪,剪心室,大概就是心臟的下半部分。放入另一干凈的PBS溶液中,再洗洗。0.1%的胰酶每次消化大概10分鐘左右,吹打后,靜置1分鐘左右,然后吸取上清,加入胰酶繼續(xù)消化。
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132-98-9     200mg    Penicillin V Potassium     青霉素V鉀標(biāo)準(zhǔn)品    
133107-64-9     5.97mg    Insulin Lispro    賴脯胰島素標(biāo)準(zhǔn)品(2-8℃)    
13311-84-7     200mg    Flutamide     氟他胺標(biāo)準(zhǔn)品    
13345-51-2     25mg        前列腺素B1標(biāo)準(zhǔn)品    
133481-09-1     30mg        加巴噴丁相關(guān)物質(zhì)B標(biāo)準(zhǔn)品    
133627-17-5     15mg        奈韋拉平相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品    
133-67-5     200mg    Trichlormethiazide    三氯噻嗪標(biāo)準(zhǔn)品 
轉(zhuǎn)化細胞   

 

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