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技術(shù)文章

外周血淋巴細(xì)胞染色體標(biāo)本制備與分析

閱讀:851          發(fā)布時(shí)間:2017-4-18

1. 轉(zhuǎn)化細(xì)胞采血及接種培養(yǎng) 
1.1 在酒精燈火焰上,用滅菌注射器(一次性注射器)抽取肝素0.2ml,使肝素濕潤至管壁。 
1.2 常規(guī)消毒后,采集外周靜脈血5ml,轉(zhuǎn)動注射器使血液與肝素混勻。 
1.3 在超凈工作臺中,預(yù)先將RPMI 1640液體培養(yǎng)基(5ml,含植物血凝素60mg/ml、10%小牛血清)加入消毒好的小培養(yǎng)瓶中,再滴加25滴全血(6號針頭),水平搖動混勻。 
1.4 置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)。培養(yǎng)過程中每天水平搖動培養(yǎng)物1~2次,使血液均勻懸浮,再繼續(xù)培養(yǎng)。 
1.5 終止培養(yǎng)前2~4小時(shí),加入秋水仙素,使終濃度達(dá)到0.2μg/ml。輕輕搖動培養(yǎng)瓶,使秋水仙素混勻。繼續(xù)培養(yǎng)至72小時(shí)。 

2.制片 
2.1 收集轉(zhuǎn)化細(xì)胞時(shí),去掉瓶塞,用乳頭吸管吸取培養(yǎng)液,充分混勻培養(yǎng)物,再將全部培養(yǎng)物吸入刻度離心管中。 
2.2 1000 rpm離心8分鐘(注意先配平)。 
2.3 棄上清液,加入37℃預(yù)溫的 0.075 mol/L KCl溶液8 ml,用吸管輕輕吹打細(xì)胞團(tuán)混勻后,置37℃恒溫水浴箱低滲處理25分鐘。 
2.4 加入 1ml新配制的固定劑(甲醇:冰乙酸=3:1),用吸管小心吹打、混勻,1000rpm離心8分鐘。 
2.5 棄上清液,加入8ml固定劑,吹打細(xì)胞團(tuán)制成細(xì)胞懸液后,室溫下固定20分鐘。 
2.6 1000 rpm離心 8分鐘。 
2.7 棄上清液,重復(fù)固定一次。 
2.8 棄上清液,根據(jù)細(xì)胞數(shù)量的多少適當(dāng)加入數(shù)滴新配制的固定劑,吹打細(xì)胞制成懸液。 
2.9 吸取少量細(xì)胞懸液,滴2~3滴于冰水浸泡過的載玻片上,吹散,氣干。 
2.10 將標(biāo)本置Giemsa染液中,染色8分鐘,水洗去浮色,氣干。 
2.11 轉(zhuǎn)化細(xì)胞顯微鏡下觀察染色體標(biāo)本分裂相的多少及分散情況。 

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