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上海仁捷生物科技有限公司
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豬雄烯酮（ADT）ELISA試劑盒-競爭法檢測原理
本試劑盒采用競爭法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。在預包被抗豬雄烯酮（ADT）抗體（固相抗體）的微孔酶標板中，加入豬雄烯酮（ADT）校準品和待測樣本，再加入HRP標記的豬雄烯酮（ADT）抗原（酶標抗原），經過溫育與充分洗滌，去除未結合的組分，在微孔板固相表面形成固相抗體-酶標抗原的免疫復合物。加底物A和B，底物在HRP催化下，產生藍色產物，在終止液（2M 硫酸）作用下，最終轉化為黃色，在酶標儀450nm波長上測定吸光度（OD值），吸光度（OD值）與待測樣品中豬雄烯酮（ADT）的濃度負相關。擬合校準品曲線，可以計算出樣本中豬雄烯酮（ADT）的濃度。
試劑盒限制性
1、 僅供科研使用，不得用于臨床診斷。
2、 在試劑盒標示的有效期內使用，過期產品不得使用。
3、 跟其他廠家的試劑盒或者組分不能混用。
4、 使用試劑盒配套的樣品稀釋液。
5、 如果樣本值高于最高標準品濃度值，請將樣本適當稀釋后，再重新測定。
6、 待測樣本中存在的人抗鼠等異嗜抗體會干擾檢測結果，檢測前，請排出該因素。
7、 通過其他方法得到的檢測結果，與本試劑盒測定結果不具有直接的可比性。
技術提示
1、 混合蛋白溶液時，避免起泡。
2、 加校準品與樣本時，每個校準品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分應該懸臂加樣，避免交叉污染。
3、 合適的溫育時間，和充分的洗滌步驟，是保證實驗結果準確性的必要條件。
4、 使用自動洗板機時，加入一個30秒浸泡的步驟，可以提高檢測精度。
5、 底物溶液為無色液體，保存過程中變為藍色，代表底物溶液已經失效，不得使用。
6、 終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致，加入終止液后，藍色底物產物，會瞬間變為黃色。
7、 實驗中，用剩的板條，應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。
8、 所有液體組分，使用前充分搖勻，嚴格按照說明書標明的時間、加樣量及加樣順序進行溫育操作。
試劑盒組分與保存
未開封的試劑盒保存在2-8度，不得使用過期試劑盒。
組分 | 數量 | 主要成分 | 開封后儲存 |
校準品 | 0.3ml/管 | -- | 2-8℃14天 |
包被微孔板 | 96T/48T | 預包被固相抗體 | 2-8℃14天 |
HRP標記抗原 | 10mL | HRP標記的檢測抗原 | 2-8℃180天 |
底物液A | 6mL | 0.01%過氧化氫 | 2-8℃180天 |
底物液B | 6mL | 0.1%TMB | 2-8℃180天 |
終止液 | 6mL | 2mol/L稀硫酸 | 2-8℃180天 |
樣本稀釋液 | 6mL | PBS | 2-8℃180天 |
20×濃縮洗滌液 | 25mL | 0.05%Tween20 | 2-8℃180天 |
說明書 | 1份 | -- | -- |
自封袋 | 1個 | -- | -- |
不干膠 | 2片 | -- | -- |
標準品濃度依次為：12、6、3、1.5、0.75、0 nmol/L.
操作程序
所有試劑和組分都先恢復到室溫，標準品、質控品和樣品，建議做復孔。
1、 按前面說明書描述的方法，配制好試劑盒各種組分的工作液。
2、 從鋁箔袋中取出所需板條，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。
設置標準品孔、空白孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL，空白孔不加，樣本孔加待測樣本50μL。
3、除空白孔外，標準品孔和樣本孔，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗原100μL。
1、 用封板膜蓋住反應板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
2、 揭開封板膜，棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置20S，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復5次。若使用自動洗板機，請按洗板機操作程序進行洗板，添加浸泡30s的程序，可以提高檢測的精度。洗板結束，加底物前，要在干凈不掉屑的紙上，充分拍干反應板。
3、 將底物A和B按1:1體積充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜蓋住反應板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15min。
4、 所有孔加入終止液50μL，在酶標儀上讀取各孔吸光度（OD值）。
結果計算
1、 以標準品濃度做為橫坐標，對應的吸光度（OD值）作為縱坐標，利用計算機軟件，采用四參數Logistic曲線擬合（4-pl），創建標準曲線方程，通過樣本的吸光度（OD值），利用方程計算樣品的濃度值。
2、 如果樣品被稀釋，通過上述方法測的濃度值，要乘以稀釋倍數，才是樣品的最終濃度。
試劑盒性能指標
1、物理性能
試劑盒的各液體組分應澄清透明、無沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應真空包裝，無破損漏氣。
2、劑量反應曲線線性
校準品劑量反應曲線相關系數r值，大于等于0.9900。
3、精密度
批內精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在同一個板塊內精度評估。批內變異系數CV%小于10%。
批間精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在不同板塊內精度評估。批間變異系數CV%小于15%。
4、靈敏度
檢出劑量小于0.1 nmol/L。
5、回收率
三組已知的高、中、低濃度樣品，進行五次在同一個板塊內回收率評估，回收率在85%-115%之間。
6、特異性
本試劑盒識別天然和重組豬雄烯酮（ADT），與結構類似物無交叉。
7、穩定性
2℃-8℃保存，有效期6個月。
5、 檢測范圍
0.375 nmol/L - 12 nmol/L
