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瘦素檢測試劑盒（酶聯免疫法）操作說明
瘦素檢測試劑盒（酶聯免疫法）
【產品名稱】
通用名稱：瘦素檢測試劑盒（酶聯免疫法）
英文名稱：Leptin (Sandwich) ELISA
【產品規格】
96T
【預期用途】
試劑盒可用于人血清和血漿中瘦素的定量檢測。
【檢測原理】
DRG公司的瘦素酶免實驗是一種基于夾心法原理的固相酶免吸附實驗（ELISA），微孔內包被有能結合瘦素分子上*抗原位點的單克隆抗體。含有內源性瘦素的病人樣本在包被孔中與特異性兔抗瘦素抗體進行溫育，之后就會形成一個夾心復合物。溫育后，用洗滌液洗去未結合的物質，再加入鏈霉親和素過氧化物酶復合物來檢測結合的瘦素，加入底物溶液，顏色強度與病人樣品中瘦素的濃度成正比。
【試劑盒組成成分】
微孔板 12×8
包被了抗瘦素單克隆抗體。
標準品（0~5） 6×0.5ml
濃度0、2、5、25、50、100ng/ml 內含無汞防腐劑。
質控品 2×0.5ml
即用型、具體數值與范圍請見試劑瓶標簽或QC質控單、內含無汞防腐劑。
分析緩沖液 1×11ml
即用型
抗血清 1×11ml
即用型、生物素化抗瘦素單抗、內含無汞防腐劑。
酶聯物 1×11ml
即用型、含辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素、內含無汞防腐劑。
底物液 1×14ml
含TMB、即用型。
終止液 1×14ml
即用型、內含0.5M的H2SO4、避免接觸終止液、以免刺激皮膚或灼傷皮膚。
洗滌液 1×30ml
40倍濃縮
注：根據需要可額外訂購樣本稀釋用的零標準品。
所需材料（未提供）
1) 酶標儀 （450±10nm）
2) 精確取樣槍
3) 吸水紙
4) 蒸餾水
5) 計時器
6) 半對數坐標紙或數據處理軟件
【儲存條件】
未開封的試劑在2~8℃下可保存至有效期，不要使用過期的試劑。
開封的試劑和微孔板必須貯存于2~8℃，密封袋一旦打開后，應立即密封好。
【樣本要求】
此試驗采用血清或血漿。
不要使用溶血，脂血或黃疸血樣本。
注意：含有疊氮化物的樣本不能使用。
樣本采集
血清
靜脈采血采集全血，允許凝集，室溫下離心分離出血清；樣本未*凝集前不能離心；含有抗凝劑的樣本可能需要更長的凝集時間。
血漿
將全血采集至含有抗凝劑的離心管內，離心分離。
樣本儲存
樣本采集后蓋好蓋子，2~8℃下可保存24小時；若要保存更長時間，則需凍存于-20℃；解凍的樣本實驗前來回倒置數次混勻。
樣本稀釋
初次試驗中，若出現樣本的濃度值高于最高標準，則需將樣本進行進一步的稀釋，并重新檢測，最終結果應乘以相關的稀釋因子。
例如：
A) 1:10稀釋 10ul的血清+90ul的零標準品（充分混合）
B）1:100稀釋 10ulA)1:10稀釋的+90ul的零標準品（充分混合）
【檢測方法】
實驗前將所有試劑和試驗所需板條平衡至室溫。
標準品
加0.5ml的去離子水至標準品試劑瓶內，，靜置10分鐘，使用前混勻。
注意：配制的標準品在2~8℃下可保存6周，需保存更長時間需在-20℃下凍存。
質控品
加0.5ml的去離子水至質控品試劑瓶內，，靜置10分鐘，使用前混勻。
注意：配制的標準品在2~8℃下可保存6周，需保存更長時間需在-20℃下凍存。
洗滌液
30ml的濃縮洗滌液+1170ml的去離子水混合，得到1200ml的即用型洗滌液；稀釋的洗滌液可在室溫下保存2周。
檢測步驟
每次實驗都要建立標準曲線。
1) 將實驗所需板條固定于板架上。
2) 加15ul的標準品，質控品和樣本于相應的孔內。
3) 每孔加100ul的分析緩沖液；充分混合10秒，此步中*混合很重要。
4) 室溫下，不蓋板，溫育120min。
5) 棄去孔內反應液，每孔加300ul的洗滌液洗板3次，吸水紙上拍干。
注意：試驗靈敏度和精確度與洗板準確與否相關。
6) 每孔加100ul的抗血清。
7) 室溫下溫育30min。
8) 棄去孔內反應液，每孔加300ul的洗滌液洗板3次，吸水紙上拍干。
9) 每孔加100ul的酶聯混合物。
10) 室溫下溫育30min。
11) 棄去孔內反應液，每孔加300ul的洗滌液洗板3次，吸水紙上拍干。
12) 每孔加100ul的底物液。
13) 室溫下溫育15min。
14) 每孔加50ul的終止液。
15) 加入終止液10min內在酶標儀450±10nm處讀數。
【結果計算】
1) 計算各標準品，質控品和樣本的OD均值。
2) 在半對數坐標紙上，以標準品的OD均值為Y軸，濃度為X軸繪制標準曲線。
3) 樣本的濃度可直接從標準曲線上讀取。
4) 自動計算方法：說明書中的標準曲線是通過4參數邏輯函數法計算得到，4PL是最佳方法，其他的方法可能會有些許的偏差。
5) 樣本濃度可直接從標準曲線上讀取；若樣本濃度值高于最高標準品，則需進一步稀釋重新檢測；最終結果計算時應乘以相關的稀釋因子。
典型標準曲線示例
以下數據僅供解釋說明，不能用作試驗的計算。
標準品（ng/ml） | OD值（450nm） |
0 | 0.02 |
2 | 0.07 |
5 | 0.16 |
25 | 0.74 |
50 | 1.41 |
100 | 2.30 |
【注意事項】
1) 此試劑盒僅供科研使用。
2) 試劑盒內所有含人血清或血漿的試劑都已經過FDA檢測HIV I/II, HBsAg 和HCV呈陰性，但使用及處理時應視其為潛在生化危害物質對待。
3) 實驗開始前，認真閱讀試劑盒內配套的使用說明書，確保*理解。
4) 微孔板可拆，未使用的板條應放回至密封袋內貯存于2-8℃。
5) 每次加樣要快，加樣順序應一致。
6) 一個試劑瓶只能用于裝一種試劑，尤其是底物液試劑瓶；若用裝過了酶聯物的試劑瓶重新裝底物液的話則會發生的溶液顏色改變，且不能將剩余溶液倒回至原試劑瓶，以免污染試劑。
7) 微孔板內的試劑應*混勻，確保得到好的結果，不要重復使用微孔板。
8) 試驗中，不要使微孔出現干燥，洗板后立即加入下一個試劑。
9) 實驗前將所有試劑平衡至室溫，溫度會影響吸收值的讀取，但是樣本值不會受影響。
10) 不要用嘴吸樣，避免接觸試劑和樣本。
11) 實驗區禁止抽煙，飲食或化妝。
12) 處理樣本和試劑時佩戴一次性手套，微生物污染的試劑或樣本會導致錯誤的結果。
13) 嚴格按照相關國家生物安全法規要求來處理。
14) 不要使用過期的試劑。
15) 加樣量嚴格按說明書要求來，使用校準加樣器和酶標儀則會得到最佳結果。
16) 不要混合使用不同批次的試劑，也不能交換同一批次的板條；運輸或貯存環境不同和微孔板的結合特性會導致結果些許差異。
17) 避免接觸終止液，會腐蝕和燒傷皮膚。
18) 含有Proclin 300, BND 和 MIT作為防腐劑的試劑應避免接觸，若接觸到則立即用大量水進行沖洗。
19) TMB底物液具有刺激作用，若接觸到則立即用肥皂清洗和大量水沖洗。
20) 化學物質和配制的試劑應根據國家生化危害安全規章要求處理。
21) 試劑盒內相關危害物質信息詳見MSDS，可向DRG索取。
【操作注意事項】
1) 實驗前，所有試劑和樣本都應平衡至室溫，混合時避免出現氣泡。
2) 實驗一旦開始，必須無中斷的完成全部試驗。
3) 避免交叉污染，每次加樣時都使用新的槍頭。
4) 吸收值與溫育時間和溫度有關，試驗開始前，將所有試劑準備好，打開蓋子，所需板條固定于板架上等，確保無間斷的，時間間隔一致的加樣。
5) 酶反應一般規則，時間和溫度是一個線性相關關系。
僅供科研使用
