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在腫瘤免疫治療領域，特異性T細胞療法跟傳統治療方法顯著不同，具有顯著的抗腫瘤效果，被認為是癌癥治療的有效方案之一。其中，小鼠T細胞特異性識別腫瘤抗原的特異性T細胞免疫療法在抗腫瘤治療領域具有重要作用。Absin新推出的小鼠腫瘤抗原特異性T細胞檢測刺激試劑盒是一款專門用于小鼠體內腫瘤特異性T細胞檢測和分析的試劑盒。該試劑盒基于先進的免疫學和分子生物學技術，通過提供特定的腫瘤抗原刺激劑，刺激T細胞增殖和活化，最終通過流式細胞術或ELISPOT定量檢測激活的腫瘤抗原特異性T細胞含量，從而實現對抗腫瘤藥物或腫瘤疫苗的效果評價。

多樣本檢測，包括：

1）小鼠外周血免疫細胞中的腫瘤抗原特異性T細胞的含量；
2）小鼠脾細胞中的腫瘤抗原特異性T細胞的含量；
3）小鼠淋巴結細胞中的腫瘤抗原特異性T細胞的含量；
4）小鼠腫瘤組織細胞中的腫瘤抗原特異性T細胞的含量；

圖1 腫瘤抗原特異性T細胞

一、產品介紹

腫瘤抗原特異性T細胞是殺傷癌細胞的主力，由于癌細胞和腫瘤抗原的高度異質性，癌細胞沒有一種或多種占主導的抗原，因此也就沒有幾種占主導的抗原特異性T細胞，而傳統的使用幾種多肽抗原或MHC四聚體技術等檢測腫瘤抗原特異性T細胞時，只能檢測針對幾種已知特定抗原的抗原特異性T細胞，導致檢測的抗原特異性T細胞不全面、不準確。

該試劑盒檢測納米顆粒負載癌細胞的全細胞抗原，抗原種類全面、多樣和廣譜，可全面準確檢測不同組織中的腫瘤抗原特異性T細胞。具有特異性高，準確性高，所檢測腫瘤抗原特異性T細胞種類全面等優點。

二、產品分類&組成

三、使用方法&檢測步驟

1、在細胞培養皿或細胞培養板各孔中加入待檢測細胞和相應的培養基，細胞濃度0.8*10⁶-5*10⁶個細胞/mL，考慮到細胞損失和流式細胞術檢測的準確性，建議至少使用100萬個細胞以上，建議使用12孔或24孔板培養，至少使用1-2mL以上培養基；

2、向其中加入使用PBS或相應培養基重懸后的納米粒子；（本檢測試劑盒中檢測納米粒子使用終濃度為0.5mg/mL-1.0mg/mL）

3、納米粒子與待檢測細胞共孵育32-48h；

4、在培養基中加入Brefeldin A Solution (BFA) (1000*稀釋到細胞培養基中)，共孵育4h；

5、使用移液器吹打收集培養基中的懸浮細胞，收集完細胞后將樣品細胞在400-500g離心5min，棄去上清液后收集細胞；

6、收集完細胞后將樣品細胞重懸于1mL PBS中；

7、除空白對照之外，每個樣品加入2μL活死細胞染料標記活細胞和死細胞，混合均勻，冰上避光孵育15-30min；

8、孵育完畢后，400-500g離心5min，用100μL FACS buffer重懸細胞；

9、除空白對照之外。每個樣品中加2μL Fc Block封閉免疫細胞表面的Fc受體，混勻后冰上孵育5min；

10、孵育完畢后，每管加入相應的不同熒光染料標記的膜標記抗體CD3抗體、CD4抗體、CD8抗體，冰上孵育15-30min；

11、直接加入500μL 4%多聚甲醛固定細胞，冰上孵育40-60min；

12、400-500g離心5min，棄去上清液，然后加100μL破膜劑重懸細胞，冰上孵育30min；

13、孵育完畢后，每管加入相應的熒光染料標記的IFN-γ抗體，冰上孵育30min；

14、400-500g離心5min，棄去上清后用200μL FACS buffer 重懸細胞或者使用500μL 4%多聚甲醛固定細胞，冰上孵育40-60min后再檢測；

15、使用流式細胞術檢測所標記抗體為陽性的細胞比例；（注：上機檢測時需先過400目濾布之后再檢測）

16、使用流式細胞術分析軟件分析活細胞中的CD3+IFN-γ+ 、CD3+CD4+IFN-γ+和CD3+CD8+IFN-γ+的T細胞占相應細胞的比例，即為腫瘤抗原特異性T細胞的比例和含量（細胞越多檢測越準確。建議檢測時活細胞收取數大于10萬，最好收集的活細胞數大于20萬）。

四、注意事項

1、本產品僅為體外檢測用產品，不可食用，也不可注射使用等；請放置在遠離兒童可及的范圍；
2、現配現用，一旦使用培養基或PBS重懸納米顆粒后立即加入待檢測細胞中混合；
3、使用過程中可根據需要自由搭配所使用的不同抗體的熒光探針；
4、請將固定后的細胞放置在4℃并于一周內完成檢測；
5、本產品只適用于小鼠樣本的檢測。

五、實驗結果

1、使用負載B16F10腫瘤組織全細胞抗原的納米粒、負載8種B16F10的新抗原多肽的納米粒、以及游離的B16F10腫瘤組織裂解液分別與小鼠脾細胞單細胞懸液共孵育激活腫瘤抗原特異性T細胞后，在CD3+T細胞中可以表達IFN-γ的T細胞比例，如下圖所示。

圖2 負載B16F10腫瘤組織全細胞抗原的納米粒

圖3 游離的B16F10腫瘤組織裂解液

圖4 負載8種B16F10的新抗原多肽的納米粒

2、小鼠淋巴結細胞和脾臟細胞檢測結果，如下圖所示。

圖5 小鼠淋巴結細胞和脾臟細胞檢測結果圖

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