一、RNA提取
1、樣本裂解：
組織樣本： Trizol用量：每 50-100 mg 組織加 1 mL Trizol，樣品體積不應超過 Trizol 體積的 10％。
（1）將動物或植物組織切成小塊，在液氮中磨碎或用勻漿器勻漿處理。
（2）將研磨好的組織粉末快速轉入裝有 1 mL Trizol 的 2 mL 離心管中，在渦旋振蕩器上迅速振蕩混勻，置于冰上， 待所有的樣品研磨完。
（3）裂解產物應呈澄清的透明粘稠液體。對于富含蛋白、脂肪或多糖物質的組織樣品如肌肉、脂肪組織和植物結節部位等，勻漿后仍會存留有不溶物質，可于 4℃ 12,000 x g 離心 10 min，然后吸取上清至一新的離心管中。
細胞樣本：
（1）貼壁細胞：吸盡培養液，每 10 cm2培養面積（6 孔板單孔或 35 mm 平皿）加入 1 mL Trizol，用加樣器吹打數次，以確保細胞裂解，然后轉移至離心管中。 注：Trizol 的使用量應由培養皿表面 積決定，而非由細胞數目決定。Trizol 量不足可能導致提取的 RNA 中有 DNA 污染 。
（2）懸浮細胞：離心收集細胞，吸盡液體，每 5-10×106動植物或酵母細胞，或每 1×107細菌細胞加入 1mL Trizol， 用加樣器吹打，使其裂解，然后轉移至離心管中。 注：添加 Trizol 前切勿洗滌細胞 ，以免 RNA 降解。必要時可以用勻漿器來裂解某些細菌或者酵母細胞 。
2、液相分離：
（1）裂解產物于室溫放置 5 min，使核酸-蛋白復合物分離。（注：此時樣品可在-80℃長期保存。 ）
（2）每 1 mL Trizol 加入 0.2 mL 氯仿，蓋緊管蓋，劇烈振蕩 15 s，室溫放置 2-3 min。
（3）4℃ 12,000 x g 離心 15 min，樣品會分成三層：桔黃色的下層有機相，中間層和無色的上層水相。
（4）吸取含總 RNA 的上層水相至一新的離心管中，吸取水相的體積為所用 Trizol 試劑的 60％。
3、RNA 回收
（1）按照每 1 mL Trizol 的最初使用量加入 0.5 mL 異丙醇，顛倒數次混勻，室溫放置 10 min。
（2） 4℃ 12,000 x g 離心 10 min，棄除上清，可見膠狀的 RNA 沉淀。
（3）按照每 1 mL Trizol 的最初使用量加入 1 mL 75%乙醇，顛倒數次混勻，洗滌沉淀。
（4）4℃ 12,000 x g 離心 5 min，棄除上清。
（5）室溫倒置 5-10 min 晾干或真空抽干（不要使用真空干燥離心機，以免 RNA 過干，難以溶解）。
（6）加入適量（如 25uL） DEPC-ddH2O 或 TE 緩沖液，用加樣器吹打數次溶解 RNA。
（7）通過 RNA 電泳以及紫外分光光度計檢測，確定 RNA 的濃度、純度和完整性。
（8）所得的 RNA 應立即使用或適量分裝后-80℃保存，避免反復凍融。
產品推薦：
貨號 | 產品名稱 | 規格 | abs60154 | Trizol | 100mL/500mL | abs9331 | Trizol（總RNA抽提試劑盒） | 1kit | abs9259 | 無酶無菌水 | 500mL |
二、逆轉錄
1、去除RNA中基因組DNA殘留：
組分 | 體積 | RNA模板* | ≤ 1 ug total RNA 或≤ 0.1 ug poly(A) mRNA | 5×gDNA remover buffer | 2 uL | gDNA remover | 1 uL | Nuclease-free Water (DEPC-treated) | 補足至10 uL |
混勻，并短暫離心，反應條件為37℃，5 min。
* 采用自備的序列特異性引物時，RNA 模板的量可調整為“≤ 5 ug total RNA 或≤ 0.5 ug poly(A) mRNA"
2、在上述的反應管中，直接添加如下的反轉錄反應所需組分，進行第一鏈cDNA 的合成步驟：
組分 | 體積 | gDNA remover 處理后RNA 樣品 | 10 uL | 5 x Buffer (with primer) | 4 uL | Enzyme mix | 1 uL | Nuclease-free Water (DEPC-treated) | 補足至20 uL |
3、輕輕混勻，短暫離心；42℃孵育15-50 min。注意：復雜模板逆轉錄溫度可升高至50℃，提高反轉錄效率。
反應時間可根據實驗應用場景做適當調整。如合成的cDNA 用作qPCR 模板，則反應條件為42℃孵育15 min。
4、85℃加熱5 min 失活Enzyme mix。
5、反應結束后所得的cDNA，請置于冰上進行后續實驗或冷凍保存。
產品推薦：
貨號 | 產品名稱 | 規格 | abs601510 | First-strand cDNA Synthesis Mix With gDNA Remover | 50T/100T/200T |
三、qPCR實驗
染料法qPCR （以abs601511產品為例）
用戶需自備的試劑：cDNA 或 DNA 模板、引物、ROX Reference Dye/ROX Reference Dye II。
請按照不同品牌熒光定量PCR儀的使用說明書要求進行實驗操作。
操作示例：分別以20 µ l和50 µ l PCR反應體系為例：
1、PCR 反應體系的建立：
組分 | 20uL體系 | 50uL體系 | DNA模板 | 1uL | 1uL | 正向引物（10uM) | 0.5uL | 1uL | 反向引物（10uM) | 0.5uL | 1uL | 2×RealStar Green Fast Mixture | 10uL | 25uL | ROX Reference Dye/ROX Reference Dye II | 0.4uL | 1uL | RNase-free H2O | 補足至20uL | 補足至50uL |
注：
*模板量： 10-100 ng基因組DNA，或 1-10 ng cDNA 為參照，因不同物種的模板中含有的目的基因拷貝數不同，可對模板進行梯度稀釋，以確定最佳的模板使用量。 另外， Two Step RT-PCR 反應的cDNA（ RT 反應液）作為模板時的添加量不要超過 PCR 反應液總體積的10% 。
*引物：通常引物濃度以 0.2 μM 可以得到較好結果，可以終濃度 0.1-1.0 μM 作為設定范圍的參考。擴增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發生非特異性反應時，可降低引物濃度，由此優化反應體系。為了獲得理想的 qPCR 的效果，擴增片段的長度建議為 80-200 bp 。
*不同儀器所需 ROX Reference Dye不同，或需要添加或不需要添加，請根據儀器說明進行操作。
2、PCR 反應條件的設置： 本制品中使用的HotStart Taq DNA Polymerase是利用抗Taq抗體封閉的HotStart DNA聚合酶，如果在PCR反應 前進行模板的預變性，通常設定為95℃、2 min，復雜或高GC模板適當延長時間至5 min。該DNA聚合酶在15 s內可完成至 少300 bp的擴增，可以滿足絕大多數的qPCR實驗；對于超過350 bp或者高GC含量的擴增子，建議增加延伸時間至60 s或者采用三步法以提高擴增效率。
兩步法 PCR 擴增標準程序： | 預變性 | 95℃ | 2min | 40 Cycles | 變性 | 95℃ | 15s | 退火/延伸 | 60℃ | 15-30s | 溶解曲線（儀器自動設置） |
三步法 PCR 擴增程序： | 預變性 | 95℃ | 2min | 40 Cycles | 變性 | 95℃ | 15s | 退火 | 60℃ | 15-30s | 延伸 | 72℃ | 30s | 溶解曲線（儀器自動設置） |
注 ： 以上舉例為常規 qPCR反應系統，僅供參考。實際反應條件因模板、引物等的結構不同而各異 ， 需根據模板、引物、目的片段的特點設定最佳反應條件，并根據比例放大或縮小反應體系。
3、在相應的 Real Time PCR 儀器上完成實驗，并分析結果。
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貨號 | 產品名稱 | 規格 | 應用 | abs601511 | 2×預混實時熒光定量快速PCR反應體系 | 1.7mL×3 | 染料法qPCR | abs601512 | 2×預混實時熒光定量快速PCR反應體系（高濃度ROX） | 1.7mL×3 | 染料法qPCR | abs601513 | 2×預混實時熒光定量快速PCR反應體系（低濃度ROX） | 1.7mL×3 | 染料法qPCR | abs60305 | 探針法熒光定量PCR試劑盒 | 100T/200T/500T | 探針法qPCR | abs60307 | 探針法超級多重熒光定量PCR試劑盒 | 100T/200T/500T | 探針法qPCR |
耗材產品推薦：
貨號 | 產品名稱 | 規格 | abs7089 | 0.1mL PCR反應板（透明，半裙邊） | 1箱 | abs7090 | 0.1mL PCR反應板（透明，無裙邊） | 1箱 | abs7091 | 0.2mL PCR反應板（透明，半裙邊） | 1箱 | abs7092 | 0.2mL PCR反應板（透明，無裙邊） | 1箱 | abs7246 | 熒光定量PCR封板膜（壓敏強粘） | 1盒 | abs7247 | 熒光定量PCR封板膜（24/48孔，壓敏） | 1盒 | abs7248 | PCR封板膜（強粘高透） | 1盒 | abs7093 | 100uL PCR 8連管（帶蓋） | 1箱 | abs7094 | 200uL PCR 8連管（帶蓋） | 1箱 | abs7119 | 1.5mL離心管（無菌無酶） | 1箱 | abs7118 | 0.5mL離心管（無菌無酶） | 1箱 | abs7071 | 10uL濾芯吸頭（盒裝 無菌無酶） | 1箱 | abs7074 | 200uL濾芯吸頭（盒裝 無菌無酶） | 1箱 | abs7077 | 1000uL濾芯吸頭（盒裝 無菌無酶） | 1箱 | abs7176 | 20uL濾芯吸頭（盒裝 無菌無酶） | 1箱 | abs7072 | 10uL吸頭（盒裝 無菌無酶） | 1箱 | abs7073 | 10uL吸頭（袋裝 無酶） | 1箱 | abs7075 | 200uL吸頭（盒裝 無菌無酶） | 1箱 | abs7076 | 200uL吸頭（袋裝 無酶） | 1箱 | abs7078 | 1000uL加長吸頭（盒裝 無菌無酶） | 1箱 | abs7079 | 1000uL吸頭（盒裝 無菌無酶） | 1箱 | abs7080 | 1000uL吸頭（袋裝 無酶） | 1箱 | abs7081 | 1000uL加長吸頭（袋裝 無酶） | 1箱 |
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