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免疫 (共) 沉淀 (IP/CoIP) 磁珠法VS瓊脂糖珠法

閱讀:1411      發布時間:2024-1-23
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免疫 (共) 沉淀 (IP/CoIP)

 

是基于抗體和蛋白的特異性親和作用,通過捕獲與蛋白或抗原特異性結合的抗體,進而從復雜的樣品中捕獲及富集目標蛋白,同時可以測定與之相互作用的蛋白或其它生物大分子的一種技術。

 

瓊脂糖珠VS磁珠

 

瓊脂糖珠作為免疫沉淀實驗中的固相支持物已經歷經多年,隨著實驗技術的發展,磁珠開始大幅取代瓊脂糖珠,成為免疫沉淀純化方法的首先選擇,許多剛接觸的研究者都要面臨方法選擇的問題,磁珠法VS瓊脂糖珠法,區別在哪里?分別有什么優缺點?


圖1 瓊脂糖珠結構


圖2 磁珠

 

區別:

 

1、抗體結合量:瓊脂糖珠(直徑50-150μm)明顯大于磁珠(直徑1-4μm),所以單個瓊脂糖珠結合抗體的量大于磁珠,但是磁珠每體積的磁珠比瓊脂糖珠的量多;
2、結合能力:瓊脂糖珠是多孔的海綿狀結果,與抗體的結合能力優于磁珠;
3、非特異性結合:瓊脂糖珠的非特異性結合比磁珠多,樣品中的非目的蛋白或者抗體的任何部位都可能與之結合,所以在瓊脂糖珠法中,樣品的預處理非常重要;
4、抗體的損耗:瓊脂糖珠大于磁珠,由于瓊脂糖珠的多孔結構,抗體很容易被困其中,并且,離心洗滌的過程中很容易流失;
5、實驗時間:磁珠法可室溫短時間孵育(僅限Absin abs9649和abs955的比較);
6、特殊設備:磁珠法需要自備磁力架。

 

abs9649(磁珠法)和abs955(瓊脂糖珠法)常見問題:


圖 abs9649免疫(共)沉淀(IP/CoIP)試劑盒(磁珠法)


圖 abs955免疫(共)沉淀(IP/CoIP)試劑盒

 

以下問題僅針對愛必信現有兩款試劑盒abs9649和abs955

 

一、樣品處理


1、兩個試劑盒中lysis buffer都要添加PMSF嗎,怎么使用?

 

兩個試劑盒中的PMSF都要額外準備,推薦abs9146,根據使用量,取每1mL lysis buffer加入10ul PMSF(100mM,溶解174mg的abs9146于足量的異丙醇中,定容到10mL,分裝成小份貯存于-20℃。)使PMSF的最終濃度為1mM,混勻備用 (PMSF現用現加)。磁珠法緩沖液請按說明書配置后使用,buffer稀釋均可用超純水。

 

2、abs9649如果沒有超聲破碎儀的話,能不能用酶解的辦法破碎細胞?

 

酶解和超聲都可以,酶按照實驗室正常使用濃度配制即可。

 

3、蛋白的量如何估算?

 

可以使用BCA蛋白定量試劑盒(abs9232)。

 

4、如果我的細胞裂解物里面蛋白含量高于試劑盒要求的總蛋白含量,我應該用什么試劑進行稀釋呢?

 

常規用PBS稀釋即可。

 

二、如何減輕瓊脂糖珠非特異性吸附?

 

可以通過多次洗滌,和樣品預處理(適當延長Protein A和Protein G的孵育時間)來降低背景,但應注意,選擇此步驟后,試劑盒中protein A和protein G對應實驗樣本數減半。

 

三、結合過程中,4℃混合過夜孵育可用什么儀器?

 

可以用混合儀abs72030或abs72019。


圖 abs72019旋轉混合儀(XHE-100)

四、abs955beads出現吸不出來的情況,怎么處理?

 

吸之前需注意槍頭要剪一下再吸,如若beads吸不上來,可加入等體積的20%乙醇混勻后再吸。

 

五、如果我后續是想要跑native膠,不做變性電泳,如何選擇樣品緩沖液?

 

用不含有SDS的WB上樣緩沖液,但不經過變性,蛋白能否解離下來,我們無法確定,不能保證您后續的實驗效果。

 

六、磁珠法兩種洗脫方案的區別?

 

兩種洗脫方案均包含捕獲抗體及目的抗原,低pH 洗脫樣本中抗體為完整結構,變性洗脫樣本中抗體解離為重鏈、輕鏈,請根據后續實驗需求選擇洗脫方案。

 

*文中圖片來源于網絡,僅供學習參考用

 

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免疫印跡及免疫沉淀用(WB/IP)裂解液

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