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干貨分享:細(xì)胞樣本如何做多色?

閱讀:977      發(fā)布時間:2023-9-21
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“你好,我的樣本是養(yǎng)的細(xì)胞,我還能做多色組化嗎?”

答案是可以!對于多重?zé)晒饷庖呓M化(mIHC)來說,幾乎不挑剔樣本類型,但需要攻克一個難題——多輪洗脫。傳統(tǒng)的組織樣本經(jīng)過前期處理固定包埋,再加上防脫載玻片的助力,在洗脫過程中,脫片概率相對小,即使有小部分脫落,但影響不至于很大;而細(xì)胞樣本,有可能在一張片子上,本身細(xì)胞數(shù)量就不多,如果還有脫落,可能最后“顆粒無收”。今天Absin分享的是細(xì)胞樣本做多色的方法,其中不能缺少的依舊是我們的“老演員”——抗體洗脫液(abs994)。

 

一、建議操作步驟:

 

1)樣本準(zhǔn)備:制備細(xì)胞樣本(細(xì)胞爬片、細(xì)胞涂片等),建議直接使用腔室載玻片進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),方便后續(xù)檢測。完成制備后,用PBS簡單漂洗(2×2min);
2)細(xì)胞固定:用4%多聚甲醛常溫固定10-20min,PBS洗滌3×5min;
3)淬滅內(nèi)源性過氧化物酶:滴加3% H2O2,室溫下孵育10-30min,PBS洗滌3×5min;
4)細(xì)胞通透(胞膜指標(biāo)省略此步):滴加含1-0.25% Triton X-100的PBS溶液,室溫下處理10min,PBS洗滌3×5min;
5)封閉:滴加封閉液(5%二抗同來源封閉血清或BSA),室溫孵育30min;
6)一抗孵育:棄封閉液,滴加稀釋好的一抗工作液,于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜或37℃ 1-2h(濕盒中可加少量水,防止抗體孵育過程干片),PBS漂洗3×5min;
7)二抗孵育:滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP二抗覆蓋組織,避光室溫孵育20-50min,PBS漂洗3×5min;
8)染料孵育:滴加現(xiàn)配的1*TSA染料工作液(使用信號放大液按1:100稀釋),反應(yīng)1-10min,PBS漂洗3×5min;
9)抗體洗脫:抗體洗脫液37℃預(yù)熱,甩去PBS后,滴加洗脫液浸潤整個爬片,洗脫時間可控制在15-30min(洗脫難度:結(jié)構(gòu)性膜蛋白和細(xì)胞骨架蛋白>胞漿蛋白>胞核蛋白),PBS漂洗3×5min;
10)重復(fù)進(jìn)行步驟[5→9],直到完成所有指標(biāo)染色;
11)滴加1*DAPI工作液到樣品上,浸沒樣本區(qū)域,室溫孵育10min,PBS漂洗3×5min;
12)滴加抗熒光淬滅封片劑,用蓋玻片封片,避免氣泡;
13)掃描成像,數(shù)據(jù)分析。

 

二、注意事項(xiàng):

 

1)若某些抗體難以洗脫,建議降低一抗稀釋比例,或?qū)⒃摪悬c(diǎn)排到最后一輪進(jìn)行染色;
2)抗體洗脫液在使用時要根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整孵育時間和洗脫溫度,若時間太長有可能損傷抗原靶點(diǎn)以及細(xì)胞核形態(tài);
3)若既有膜指標(biāo)又有胞內(nèi)指標(biāo),可先做膜指標(biāo),再做胞內(nèi)指標(biāo),在進(jìn)行胞內(nèi)指標(biāo)染色之前再進(jìn)行打孔,若一開始就打孔,可能影響胞膜指標(biāo)的染色;
4)由于細(xì)胞樣本可能存在的脫片問題,可在開始多色實(shí)驗(yàn)之前先模擬多次抗體洗脫的過程,多次使用抗體洗脫液洗脫與PBS漂洗,觀察細(xì)胞脫落情況,若明場不便觀察,可染一下DAPI再觀察;
5)上述操作步驟并不一定適合所有樣本和抗體,需要根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)。

 

貨號

產(chǎn)品名稱

規(guī)格

貨期

abs50012

四色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒(鼠兔二抗)

20T

現(xiàn)貨

abs50028

四色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒(兔二抗)

20T

現(xiàn)貨

abs50013

五色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒(鼠兔二抗)

20T

現(xiàn)貨

abs50029

五色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒(兔二抗)

20T

現(xiàn)貨

abs50014

六色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒(鼠兔二抗)

20T

現(xiàn)貨

abs50030

六色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒(兔二抗)

20T

現(xiàn)貨

abs50037

七色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒plus(鼠兔二抗)

20T

現(xiàn)貨

abs50038

七色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒plus(兔二抗)

20T

現(xiàn)貨

abs994

抗體洗脫液(mIHC專用)

30ml

現(xiàn)貨

 

好消息!Absin文獻(xiàn)獎勵重磅升級!

 


Absin特色產(chǎn)品線:

WB相關(guān):ECL發(fā)光液、預(yù)染marker、預(yù)制膠;IHC相關(guān):二抗試劑盒、組化筆;IP/CoIP試劑盒;激動劑/抑制劑;血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE;凋亡試劑盒;呼吸爆發(fā)試劑盒;ELISA試劑盒;重組蛋白;抗體: 二抗、標(biāo)簽抗體、對照抗體;定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測)...

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