9
其他視頻
2025/02/13
83次播放
細胞污染是生物實驗室中常見的問題之一，輕則引起細胞狀態改變，降低實驗結果的可重復性，重則會直接導致細胞的死亡，影響實驗進度。因此，預防細胞污染，是細胞培養成功的關鍵點之一
如何控制細胞實驗過程中的污染？本期內容，為大家提供一些關鍵的方法和策略。
一、生物污染
細胞的體外生存環境，可以說是「危機四伏」。空氣中漂浮著各種肉眼難以捕捉的微生物，稍有不慎，細胞就會被感染。不僅如此，如果實驗操作不夠規范，還有可能出現細胞交叉污染的情況。
1、細菌污染
細菌是一種原核細胞微生物，一般為微米級別。細胞培養過程中常見的污染菌為大腸桿菌、葡萄球菌、假單胞菌等。
細胞發生細菌污染后，有哪些癥狀？與其他污染相比，細菌污染在細胞培養過程中「發病」更為迅速，較容易被發現。當細胞出現如下癥狀時，基本可以斷定，細胞發生了細菌污染：
①細胞培養基在短時間內迅速渾濁；
②靜置的培養液時不渾濁，但稍加震蕩，就有許多渾濁物漂起；
③顯微鏡下可見培養液中有大量圓球狀顆粒物漂浮；
④細胞停止生長、出現大量死亡；
如果細胞不幸遭遇到了細菌污染的侵襲，該如何應對呢？我們建議直接將細胞丟棄，并對培養環境消毒。國際上大多數實驗室會使用 Mycoplasma-off™噴霧劑（或濕巾），對超凈臺、培養箱等環境進行消殺。
2、支原體污染
支原體（mycoplasma）是一類沒有細胞壁、高度多形性、部分可用人工培養基培養增殖的原核細胞型微生物，大小為 0.3 微米左右。在細胞培養過程中，顯微鏡很難捕捉到它們的身影，與細胞競爭營養，影響細胞生長，最終導致實驗出現偏差，當細胞出現如下癥狀時，基本可以斷定，細胞發生了支原體污染：
①生長速率緩慢、活力下降、易脫壁；
②細胞形態改變；
③細胞易聚團；
④在顯微鏡下，可見培養液中產生大量碎片（培養基不渾濁）；
⑤在培養過程中，培養液很快變黃（意味著培養液中有看不見的大量微生物繁殖，營養被消耗）；
由于支原體體型微小，在細胞培養過程中，普通光學顯微鏡很難觀察到，只有在電鏡下才能拍到支原體的照片。細胞培養過程中的支原體污染，會大量消耗培養液中的營養。98% 會附著在細胞表面，導致細胞生長狀態發生異常，甚至引起死亡，最終導致實驗數據發生異常。
如果細胞被支原體污染，該如何處理？對與支原體污染的細胞，優先考慮丟掉細胞，重新培養。
①對于非常珍貴的細胞株（不可再得的）國際上使用 Mynox® Gold，做 4 周左右的支原體祛除持續培養實驗。
②對于非常珍貴的細胞株或生物樣品（無法長期培養的），可使用 Mynox®，對細胞做 3 小時左右的祛除支原體處理，處理完畢，沖洗細胞，將樣品放入潔凈的培養液中，重新培養或保存即可。
③對于已經進行到中途的細胞實驗，如果將培養的大量細胞丟棄，會造成高昂的實驗成本損失。對于這樣的情況，補救辦法如下：在培養液中加入 10% 的 Zell Shield®（一種新型復合抗生素）。按照廠家建議的方法，配合處理細胞，培養 4 代以上，基本可祛除支原體污染。
④一些做原代培養的實驗室，為了預防取原代細胞過程中可能會發生支原體污染，實驗人員也可以在培養液中加入 10% 的 Zell Shield®（一種新型復合抗生素），培養 4 代以上，即可撤掉 Zell Shield®，此過程可有效預防支原體污染的發生。
3、真菌污染
真菌是一類具真核和細胞壁的異養生物。真菌可以通過孢子延續種群，典型的營養體為絲狀分支結構。可污染細胞培養基的真菌種類繁多，最常見的有曲霉菌，白色念珠菌，酵母菌，黑霉菌，孢子菌等。當細胞出現上述癥狀時，基本可以斷定，細胞發生了真菌污染：
①在細胞培養液中會形成淡黃色或白色的漂浮物，肉眼可見，但培養液在短期內不變混濁；
②顯微鏡下可以看見細胞之間或是培養液中，有縱橫交錯穿行的絲狀，樹枝狀或管狀菌絲；
③多數菌絲在高倍鏡下可以觀察到鏈狀排列的菌株，而念珠菌及酵母菌菌株呈卵圓形，散落在細胞上及細胞周邊生長。
細胞發生真菌污染時，需要將細胞丟棄，并對培養環境消毒，國際上大多數實驗室會使用 Mycoplasma-off™噴霧劑，對超凈臺、培養箱等環境進行消殺。
二、加強細胞間管理，是解決細胞污染真正有效的方法
匯總了各大實驗室的工作流程：
1、在正式進入細胞間前，需要在緩沖隔離間佩戴好細胞實驗室專用的防護用具：口罩、防護服、鞋套等，開始實驗前，佩戴好手套。
2、定期使用 Mycoplasma-off™噴霧劑（或濕巾），對工作區域消殺（建議半個月一次，但需根據細胞間實際使用頻率決定）。
3、每次實驗開始前，和實驗結束后，用紫外線對細胞間進行照射消毒，實驗操作前用酒精或 Mycoplasma-off™噴霧劑對操作人員的手套進行噴涂消毒。
4、在水浴鍋或培養箱水槽的水中，加入 0.5% 的 Water Shield™，可確保一個月內水源不會變成支原體、真菌或細菌的污染源。
5、如果細胞間內，發生多株細胞的聯合的支原體污染情況，建議在做上述 1-4 的操作的同時，將液氮罐，也用 Mycoplasma-off™噴霧劑（或濕巾）進行消殺，并更換潔凈的液氮，（液氮罐中凍存的細胞發生支原體污染，也會在液氮中引起污染的的傳播）。
上述內容只分析了生物因素污染，在實際培養過程中，可能還會發生物理或化學污染，請自行排除，本文不再贅述。
三、使用高品質的實驗試劑，降低細胞污染風險
胎牛血清是細胞培養中常用的培養基補充物，以維持細胞的生長和健康。選擇高品質的胎牛血清，可以盡可能降低細胞污染的風險。
高品質的胎牛血清，血源清晰、通過嚴格的質量檢測，并在檢測報告上，表明批次、內毒素含量、無菌檢測和病原檢測情況、蛋白含量等指標，清晰且明確。以科研人常用的 Ausbian 進口特級胎牛血清為例，澳洲血源，內毒素含量 ≤ 3EU/ml，無菌檢測和病原檢測結果均為「未檢出」病毒和細菌，蛋白含量也有注明，品質如何，一目了然！
