支原體檢測的應用
支原體是細胞實驗中，常見的一類污染物。
在干細胞治療、免疫細胞治療、CAR-T、抗體藥生產、疫苗生產相關的等臨床臨床項目，以及細胞典藏等重大的細胞培養項目，都需要進行支原體放行檢測，以確保產物沒有支原體污染。
?因此，需要建立結果準確、靈敏度高、操作簡便快捷、通過《藥典》方法驗證的檢測手段。
產品名稱：支原體qPCR檢測試劑盒 (經典法)
英文：Venor®Gem qEP
貨號：11-9025
品牌：Minerva Biolabs®
規格：25次/盒
特點：遵循歐洲藥典和日本藥典檢查的流程，通過方法學驗證；靈敏度高；特異性強，操作便捷。
產品用途
德國Minerva Biolabs公司的Venor® GeM qEP kit，用于定量檢測細胞培養物，及其他生物基質中的柔膜體綱微生物，如支原體、無膽甾原體、螺原體。
作用原理
通過擴增16S rRNA編碼區特異性檢測支原體，而真核生物和其他細菌DNA不能通過Venor®GeM qEP Kit擴增。
試劑盒包含所有必要的PCR組分，內控DNA可用于鑒定PCR抑制，或DNA抽提問題帶來的假陰性。內控DNA可直接加到PCR預混液里，或加到DNA抽提之前的樣本中。它可用于驗證DNA抽提和qPCR擴增過程。它可從Minerva廠家購買（貨號11-9905）。內控對照的擴增結果在560nm檢測（HEX通道），而支原體的擴增在520nm檢測（FAM通道）。
試劑盒包括dUTP，它替代dTTP，方便用尿嘧啶DNA糖基酶（UNG）監視假陽性。該試劑盒不包含UNG。
實驗前準備
一、細胞培養篩查
細胞應長滿90%以上。細胞上清可直接用于支原體檢查，無需再樣品制備。但上清中可能累積抑制PCR的物質，此時有必要進行DNA抽提。未有證據表明，細胞培養基中的青鏈霉素存在抑制支原體或影響檢測的靈敏度的情況。
細胞培養中的支原體數量平均為1×10^6/ml，至多為1×10^8/ml，足以滿足PCR的檢測要求。PCR的模板制備如下：
1.轉移500μl細胞培養上清至1.5ml EP管，蓋緊蓋。
2.樣本孵育95℃10分鐘。
3.樣本最大轉速離心（15s）以沉淀細胞碎片。
4.取2μl直接用于qPCR，或樣品儲存在4℃，最多6天。長期保存在-20℃。
二、符合藥典的樣品檢查
1、濃縮樣品（可選步驟）
樣品基質可能對檢測方法的靈敏度有至關重要的影響。進一步提高檢測靈敏度的一種方法是收集和篩選比支原體DNA提取所需的更大樣本量的細胞培養上清(例如，Venor®GeM樣品制備試劑盒>200 μl)，并執行樣品濃縮步驟。
①轉移≤1ml樣品上清至1.5ml離心管。
②離心≥10000 × g 15分鐘（或≥13000× g 6分鐘），以沉淀支原體顆粒。
③棄掉上清，用200ml Tris緩沖液（10mM Tris-HCl，pH8.4）重懸沉淀。
④樣本渦旋混勻，然后直接進行樣本穩定化處理或DNA抽提。
2.樣品穩定化
細胞培養樣品可能含有高濃度的DNA酶，即使在較低的溫度下也會降解支原體DNA。因此，我們建議采取以下步驟來穩定樣品。如果在樣品采集后立即進行DNA提取，則不需要此步驟。請注意，在樣品濃縮步驟之前，不能通過熱失活來穩定樣品。
①轉移500ml細胞培養上清至1.5ml離心管。蓋上管蓋。
②95℃孵育10分鐘。
③最大速度進行樣本離心（15秒），以沉淀細胞碎片。
④樣本即可用于DNA抽提，或儲存在4℃，最多6天。長期保存在-18℃以下。
3.DNA 抽提
大量證據表明，DNA抽提可實現最高的靈敏度。DNA抽提有多種方法，但應適合支原體基因組。我們推薦：
Venor®GeM Sample Preparation kits （貨號56-1010/-1050/-1200) 適合手動DNA抽提。
這些DNA抽提試劑盒已經過大量驗證，具體流程參見試劑盒說明書。
注意事項
??由于細胞團塊對PCR反應的負面影響，不能直接使用細胞團塊進行檢測。因此，細胞團塊，或其他生物材料，如疫苗、冷凍儲存和石蠟包埋的樣品，需要在PCR前提取DNA。
已知樣品中胎牛血清(FCS)含量(> 5%)會增加PCR抑制的可能性。為了避免假陰性結果，這些樣品可能需要在PCR之前，也需要進行DNA提取。
Venor®GeM qEP試劑盒與Venor®GeM樣品制備試劑盒(Cat：No. 56-1010/-1050/-1200)用于支原體DNA提取
??樣品濃縮步驟只適用于完整的支原體細胞。因此，應避免在樣品濃縮之前進行“樣品穩定"，即不能再濃縮前進行任何破壞細胞的程序(如熱失活)，請參見“2.樣品穩定化"。可直接處理體積為200 μl的樣品，無需濃縮步驟。
??Venor®GeM qEP kit包含的內控DNA對照，也用于驗證DNA抽提步驟。
??樣本濃縮時不要加內控DNA。
??內控DNA可單獨購買（貨號11-9905）。
??PCR抑制可能因樣本基質或者洗脫液產生。因而我們推薦Venor®GeM Sample Preparation kit用于DNA制備，其他品牌試劑盒需要經過試驗以保證合格。
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