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CRISPR-Cas9是一種常用的基因編輯技術(shù)，可以用來改造細胞。被改造的細胞有希望應(yīng)用于各類疾病的治療。細胞治療項目需要通過支原體檢測，才有可能被用于臨床。德國MB支原體qPCR檢測試劑盒，通過歐洲藥典和日本藥典的方法學驗證。

表達轉(zhuǎn)基因T細胞受體(tcr)或嵌合抗原受體(CARs)的T細胞，已成為一些惡性腫瘤的有效治療選擇。然而，T細胞功能可因慢性刺激而失效。慢性刺激的T細胞可以分化為功能失調(diào)狀態(tài)，其特征是抑制受體(如PD-1, LAG-3和TIM-3)的表達，增殖和細胞因子的產(chǎn)生減少，轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)景觀改變。以衰竭為特征的T細胞功能障礙已被確定為治療反應(yīng)不良的主要原因因此，在包括慢性刺激和強直信號在內(nèi)的環(huán)境中，改善治療性T細胞的適應(yīng)性是改善臨床反應(yīng)的一個有希望的策略。

基因組工程的進步提供了許多增加T細胞適應(yīng)性的方法。

一種方法是在內(nèi)源性TCR α常數(shù)(TRAC)鏈13的啟動子調(diào)控下，通過靶向CAR整合或篩選共刺激結(jié)構(gòu)域來確定有利的CAR設(shè)計來調(diào)節(jié)CAR調(diào)節(jié)/信號轉(zhuǎn)導。

第二種方法使用CRISPR-Cas9去除限制持久T細胞功能的基因。從pd -1開始，crispr - cas9介導的抑制受體敲除(KO)已經(jīng)在臨床試驗中進行了嘗試功能喪失篩選繼續(xù)指出了增加T細胞適應(yīng)性的擾動，如Regnase-1和/或Roquin，Ptpn2，SOCS1，或rasa2。

作為第三種方法，使用CRISPR激活(CRISPRa)25或開放閱讀框(orf)的慢病毒文庫進行的功能獲得篩選，已經(jīng)揭示了其可能性，如淋巴蛋白β受體(LTBR)的過表達。然而，這些功能獲得篩選方法并沒有在原代人T細胞中大規(guī)模地與抗原特異性tcr或car結(jié)合，而且CRISPRa篩選不能測試合成的基因產(chǎn)物。

一種很有前景的方法是通過直接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子或通過合成表面受體(SRs)改變細胞對外部信號的反應(yīng)來設(shè)計TCR-/CAR-T細胞的狀態(tài)。例如，過表達AP-1/ATF轉(zhuǎn)錄因子(tf) c-Jun或BATF可以改善CAR-T細胞功能。許多研究小組設(shè)計了編碼“開關(guān)"受體的合成基因，通過將抑制受體的結(jié)構(gòu)域(如PD-1)融合到激活結(jié)構(gòu)域(如CD28)，將抑制信號轉(zhuǎn)化為激活信號。包括CD200R/CD28和TIM-3/CD28在內(nèi)的一系列合成受體已經(jīng)被開發(fā)出來，但需要系統(tǒng)的分析來了解控制哪些結(jié)構(gòu)域配對有效的規(guī)則。更廣泛地說，需要一種模塊化篩選方法來發(fā)現(xiàn)可以與特定tcr /CARs結(jié)合的tf或sr的組合，以提高功能性能。

靶向crispr介導的敲入蛋白(KI)篩選不僅允許在特定位點上測試構(gòu)建體，而且還克服了匯集的lenti /逆轉(zhuǎn)錄病毒篩選方法的幾個局限性:病毒重組、半隨機整合和可變整合數(shù)。研究人員之前開發(fā)了一個非病毒池KI (PoKI)平臺，并篩選了一個包含36個成員的庫，結(jié)合ny - eso -1特異性tcr。然而，由于模板切換導致的大量條形碼/構(gòu)建錯配阻礙了該方法的擴展，這限制了庫的大小和適應(yīng)性。

近日，科研人員開發(fā)了模塊化池KI篩選(ModPoKI)，這是一個使用條形碼多順子適配器模塊化構(gòu)建DNA KI庫的適應(yīng)性平臺。相關(guān)研究發(fā)表在《Cell》上，文章標題為：“Modular pooled discovery of synthetic knockin sequences to program durable cell therapies"。

研究人員構(gòu)建了兩個ModPoKI文庫，包含100個轉(zhuǎn)錄因子(tf)和129個天然和合成表面受體(SRs)。在不同條件下對人類TCR-和CAR-T細胞進行了30多次ModPoKI篩選，發(fā)現(xiàn)了一種轉(zhuǎn)錄因子AP4 (TFAP4)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在體外和體內(nèi)增強了慢性刺激CAR-T細胞的適應(yīng)性和抗癌功能。ModPoKI的模塊化使我們能夠生成一個約10,000個成員的TF組合庫。BATF-TFAP4多順反電子結(jié)構(gòu)的非病毒KI增強了適應(yīng)度。過表達的BATF和TFAP4共同占據(jù)并調(diào)控關(guān)鍵基因靶點，重編程T細胞功能。ModPoKI有助于發(fā)現(xiàn)復雜的基因結(jié)構(gòu)來編程細胞功能。總的來說，這些研究強調(diào)了大規(guī)模ModPoKI篩選是一種強大的方法，可以加速細胞狀態(tài)的編程，增強持久性和治療功能。