一、產(chǎn)品用途：
RT-PCR引物/探針（英文名：SARS-CoV-2 Confirm），用于定性檢測和分析新guan病毒RNA。它僅用于研究，不用于臨床診斷。
二、產(chǎn)品描述：
1.該產(chǎn)品包括三個小管：
①橙蓋： Mix（凍干粉），1管。
此管為新guan病毒引物/探針，可特異性擴增新guan病毒的RdRp基因（即RNA依賴性RNA聚合酶基因），而其他冠狀病毒RNA不會被檢測到【1】【2】。（該引物/探針依據(jù)WHO診斷參考實驗室公布的新guan病毒引物/探針序列而設(shè)計【1】。更多詳情可訪問
如要檢測其他冠狀病毒，推薦MB公司提供的其他冠狀病毒引物/探針，品名：CoV Screen (without ConviFlex™ RT-Taq Mix)，貨號：271-1100。
②綠蓋： Positive Control RNA（陽性對照RNA，凍干粉），1管。
此陽性對照RNA為一段合成的RNA序列（序列來自武漢的病毒株）。
③白蓋： PCR Grade Water（液體），1管。
2.使用前，①橙蓋和②綠蓋先用PCR級水（③白蓋）復(fù)溶，并分裝，避免反復(fù)凍融。
3.該引物/探針應(yīng)與MB公司提供的【RNA病毒檢測試劑盒】（英文名：ConviFlex™RT-Taq Mix,
貨號192-0025/-0100/-0250）一起使用，用于新guan病毒RT-qPCR反應(yīng)檢測。
4.檢測樣本需為抽提過的RNA樣本。
5.新guan病毒的靶基因RdRp是用FAM™通道檢測，擴增的人RNA酶P基因（過程對照）用ROX™通道檢測，用以評估樣本的制備質(zhì)量。
三、產(chǎn)品特點：
1.靶點特別。依據(jù)WHO國際標(biāo)準(zhǔn)，此引物探針為新guan病毒RdRp基因，而非市面上常見的ORF1ab和N基因或E基因。
2.陽性對照RNA為一段合成的RNA序列（序列來自武漢的病毒株）。
3.主要組分為凍干粉，4℃保存，儲存運輸方便，性能穩(wěn)定。
4.適用于科研中，各種來源的RNA樣本，包括拭子、活檢組織、哺乳動物細胞和細菌等。
四、需用戶自己準(zhǔn)備的試劑耗材和儀器：
1.RNA病毒檢測試劑盒（RT-qPCR法）（英文名：ConviFlex™ RT-Taq Mix，貨號192-0025/-0100/-0250）
2.熒光定量PCR儀（qPCR儀）
3.無DNase和RNase的qPCR反應(yīng)管
4.離心機
5.移液器及帶濾芯吸頭（不含DNase和RNase）
6.用戶自己提取的RNA或現(xiàn)成的RNA樣品。（抽提過程建議使用商品化的RNA提取試劑盒完成，如MB廠家的：
【病毒RNA提取試劑盒】（ExtractNow™ Virus RNA Kit，貨號611-1010/-1050/-1250）
或【病毒RNA拭子提取試劑盒】（ExtractNow™ Virus RNA Swab Kit，貨號611-2250）。
五、操作注意事項：
該引物/探針應(yīng)僅由經(jīng)過培訓(xùn)的實驗室人員使用。
始終穿上合適的防護服和戴一次性手套。
根據(jù)樣品類型，應(yīng)謹(jǐn)慎處理所有樣品。請遵循WHO推薦的方法處理樣本。
該試劑盒不含有害物質(zhì)。 殘余物可以根據(jù)當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)丟棄。
六、操作步驟：
步驟1. 試劑制備
①橙蓋Mix引物探針凍干粉，最大速離心5秒鐘，加入525lPCR級水（白蓋），室溫靜置5分鐘后，渦旋并離心5秒鐘，分裝，待用或-18℃保存。
②綠蓋Positive Control RNA陽性對照凍干粉，最大速離心5秒鐘，加入105lPCR級水（白蓋），室溫靜置5分鐘后，渦旋并離心5秒鐘，分裝，待用或-18℃保存。
步驟2. RT-qPCR引物/探針mix制備（20μl反應(yīng)體積）
（1）1個反應(yīng)需要加入：酶預(yù)混液 （自備的紅蓋預(yù)混液）10l ，
橙蓋（復(fù)溶的Mix引物/探針）5l
（紅蓋預(yù)混液 來自MB公司的【RNA病毒檢測試劑盒】（RT-qPCR法），
英文名：ConviFlexRT-Taq Mix, 貨號192-0025/-0100/-0250，需單獨購買）
（2）將以上引物/探針mix渦旋混勻，并離心5秒鐘。
（3）每個PCR管中加入15μl上述引物/探針mix和5μl樣本（抽提后的RNA），
或5μl RNA提取試劑盒中的洗脫緩沖液，作為陰性對照，或5μl PCR級水作為無模板對照，或5μl陽性對照RNA。
（4）緊扣PCR管，然后短暫離心。
（5）將PCR管放置qPCR儀上，緊上頂蓋。
步驟3. 設(shè)置qPCR程序
1個循環(huán)： 55 ℃，10分鐘
1個循環(huán)： 94 ℃，3 分鐘
45個循環(huán)：94 ℃，15秒
58℃，30秒
步驟4. 啟動程序
七、使用注意事項：
1.使用前應(yīng)認真閱讀說明書。
2.來自不同批次的試劑不能混合。
3.試劑盒內(nèi)的試劑應(yīng)始終作為一個整體溶解分裝。
4.試劑盒應(yīng)在效期內(nèi)使用。
5.每次PCR至少應(yīng)設(shè)置一個陽性對照。每次PCR至少應(yīng)設(shè)置一個陰性對照和/或一個無模板對照。如果實驗者自己抽提RNA，則可使用洗脫緩沖液作為陰性對照。對照必須與待測樣品的處理方式相同。您也可能需要其他實驗室提供的對照品，例如含高、中、低不同濃度的RNA樣品。使用對照，對于確認結(jié)果的可靠性或用于排除故障非常有意義。
6.建議在無RNA和DNA污染的條件下進行RT-PCR，以避免操作過程中DNA或非特異RNA的交叉污染。（MB公司推薦使用PCR污染祛除噴霧，英文名：PCR Clean™，貨號15-2025，預(yù)先清潔實驗環(huán)境。）
7.盡量減少RNA樣品的凍融次數(shù)，同時避免RNA酶污染，以減少RNA降解的風(fēng)險。（RNA降解會極大地限制了RT-qPCR反應(yīng)的性能）。請確保高質(zhì)量的完整RNA用于檢測。
8.樣本制備過程中，注意避免其他DNA的污染，DNA的干擾也會降低qPCR的準(zhǔn)確性。
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