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北京締一生物科技有限公司

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貼壁細胞如何高效傳代?

閱讀:866      發布時間:2022-9-29
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細胞培養的本質是細胞克隆技術。原理就是盡可能給細胞提供類似于體內的環境,在無菌條件下,給予適當的溫度和酸堿度以及細胞生長繁殖所必要的營養條件,使其能在體外維持正常的生長繁殖,并保持其結構和功能的技術。

細胞培養技術的應用十分廣泛,基礎醫學研究,抗體制備,新藥篩選,基因工程等等都需要用到細胞培養技術。

貼壁細胞如何高效傳代?

貼壁生長的細胞,在培養瓶或者培養皿長至單層鋪滿的狀態后后,空間已基本上飽和,細胞生長、增殖受阻,為使其繼續擴增或生長,需要進行傳代(再培養)處理。同時,傳代培養也可用于細胞種的保存。不僅如此,各種細胞實驗也是以高效的細胞傳代為基礎的。

懸浮型細胞直接分瓶就可以,而貼壁細胞則需經消化等處理后才能分瓶。

一般使用胰蛋白酶,將貼壁細胞消化成成單個細胞,也可加入EDTA提高消化能力(EDTA 是一種二價離子的螯合劑,能抑制細胞膜上的Ca2+和Mg2+)。

常用的細胞消化液一般含有0.25%(w/v)的胰酶和0.03% (w/v) EDTA。

實驗時,先用吸去細胞培養上清,用PBS清洗細胞,棄掉洗滌液,重新加入少量的胰酶-EDTA 消化液(根據培養皿的大小不同,一般2-5ml消化液即可,以剛好鋪滿整個皿底為原則),觀察細胞直到細胞變圓脫離瓶壁,此過程一般需要3-5分鐘,為了避免細胞成團,消化細胞的過程中不要拍打細胞瓶。對于特別難消化的細胞,可以加入胰酶EDTA 消化液后把細胞置于37°C 促進消化,細胞脫離瓶壁后,立刻加入含有血清的*培養基中止消化。

800-1000rpm,離心5分鐘,然后棄去中止用的培養基,加入適合的新的培養基輕輕混勻細胞,移入到新的培養瓶。傳代的比例視細胞類型而定。胰蛋白酶會對某些細胞的細胞膜產生損傷,對于這種類型的細胞,可用細胞刮輕輕刮下細胞,加入適量的培養基,輕輕吹打混勻細胞,然后進行傳代培養。

WHO公布的《用動物細胞體外培養生產生物制品規程》中的要求:

1、牛血清必須來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家,并應具備適當的監測系統。

2、有些國家還要求牛血清來自未用過反芻動物蛋白飼料的牛群。

3、證明所用牛血清中不含對所生產疫苗病毒的抑制物。

4、血清要通過濾膜過濾除菌,保證無菌。

5、無細菌、霉菌、支原體和病毒的污染,有些國家要求無細菌噬菌體污染。

6、對細胞有良好的支持繁殖作用。

我國對牛血清的質量中提出比較嚴格的標準要求:

包括蛋白質含量,細菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細菌內毒素,支持細胞增殖檢查。一款來自澳洲的Ausbian®胎牛血清在市場上頗受歡迎。它具有精選內毒素極低、產量充足的血清批次,滿足干細胞、基因敲除、原代培養、細胞典藏、長期傳代等各類細胞的培養要求;澳洲血源,完整的檢測報告及滅病毒服務,為各類臨床相關項目的申報提供完整支持等特點。


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