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干細胞標準培養方法是什么?

閱讀:980      發布時間:2022-9-14
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干細胞是一類具有無限的或者永生的自我更新能力的細胞、能夠產生至少一種類型的、高度分化的子代細胞[1]。

干細胞被認為可以提供一種理想的生物學平臺, 用于多方面的科學研究與臨床應用, 如藥物篩選平臺的建立、細胞發育與分化的分子調節機制研究、基因靶向敲除動物模型的構建、組織工程種子細胞及基因治療載體的建立、細胞治療及再生醫學等[2]。

干細胞研究離不開干細胞的培養。合格的干細胞培養的過程,包括促進其分裂增殖和維持其未分化狀態。

基于以上兩點要求,目前主流的標準培養方法為飼養層培養法:

即在有絲分裂失活的飼養層細胞 (FEEDER) 上培養干細胞。培養體系一般為高糖DMEM,添加適量的胎牛血清 (FCS) 及白血病抑制因子 (LIF)、L-谷氨酰胺等添加劑。

另外,為了避免外源性物質的干擾(如血清、病原等成分)[3],又嘗試及建立了其他培養基, 包括條件培養基 (CM) 、無飼養層、無血清、血清替代物 (SR) 非條件培養基等。

其中無血清培養基中添加了更多珍貴的細胞因子,而血清替代物培養基則采用人工/半人工合成分子替代物的形式,來替代血清,成本相較于普通胎牛血清*培養基而言,高出不少。

01

飼養層培養法

目前認為,飼養層能夠提供干細胞接觸所必需的復雜蛋白分子。自1981年EVANS等人[4]用飼養層成功培養了mESC起,飼養層培養法便開始不斷發展。實驗過程,主要分為以下三步:配制飼養層細胞培養基、準備飼養層細胞、配制飼養單層細胞培養基、飼養單層制備、配制干細胞培養基、接種干細胞培養。

飼養層培養法卻存在著不可避免的缺點:

1、 飼養層細胞生命期有限,不能在體外長期傳代。在體外傳代時間太長,其產生促增殖因子和抑制分化因子的能力會減弱甚至喪失。

2、 MEF細胞的染色體干擾:飼養層細胞會影響干細胞遺傳物質。 

3、 絲lie霉素-C的影響:飼養層細胞需要用到絲lie霉素-C,該物質可能會影響干細胞的增殖。

4、 異種抗原及污染的影響:飼養層細胞作為異種抗原也會影響干細胞的健康,還有發生細胞間融、引入其他動物源性病原體,給臨床移植治療帶來風險。

5、 所用試劑復雜,批次不可控:所用材料的批次之間的波動,限制了培養物之間的可重復性。

6、 實驗周期長,培養基配制復雜:在基礎培養基的基礎上,添加例如白血病抑制因子(LIF)[6]這樣的多功能細胞因子,但無論進口還是國產的產品,都不免有價格高昂的缺點。而自己配制,又會面臨操作繁瑣、易污染等問題。飼養層培養從培養飼養細胞開始,至少需要一周時間才能得到所需的干細胞,周期過長。

/////

02

無飼養層培養

無飼養層培養類似普通細胞培養,主要分為以下幾個步驟:培養瓶預處理、配制培養基、消化/復蘇干細胞、接種、培養。

相較于飼養層培養法,無飼養層培養法的優點顯而易見:更加簡便、節省時間;但缺點也十分明顯:

1、 培養的細胞質量不穩定:由于自行配制的培養基,不可控因素較多,缺少營養細胞對的存在,干細胞生長狀況也不穩定,直接影響實驗結果。

2、 成本高昂:商品化的培養基,根據品質不同,價格也是從幾百元到幾千元不等,直接增加了干細胞的培養成本。

3、 需要不斷對培養基進行調整,對實驗人員有很高的要求:無飼養層培養法需要人為添加各種各樣的細胞因子,不同的干細胞還需要進行細微的調整以適應不同的生長需求,因此培養難度更高,對技術人員的操作水平及經驗有很高的要求


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