熒光定量PCR法（qPCR）：是在常規PCR基礎上，將『針對支原體特異性保守序列的探針』做熒光標記，使PCR擴增后的產物帶有熒光，利用熒光信號的變化和配套軟件，進行DNA擴增反應的實時監測，簡稱qPCR。
優點：①靈敏度高、特異性強。
②時間短，2-3小時出結果。
③檢測結果可定量。
④操作簡便。
缺點：①對于已做支原體滅活處理的樣品，由于支原體DNA仍舊存在其中，PCR結果會出現假陽性。（可用培養法做補充驗證）
②不同廠家生產的試劑盒質量差異巨大（由于引物及內在設計不同），需謹慎選擇，盡量在專業人員推薦指導下使用。
支原體熒光定量PCR檢測試劑盒(qPCR經典法)(符合歐洲藥典)-熒光定量PCR檢測-北京締一生物科技有限公司
特點
1. 內控對照為獨立包裝，遵循歐洲藥典和日本藥典操作流程。
2. 高特異性，一次檢測即可涵蓋所有常見易感染細胞的支原體物種（包括歐洲藥典規定的9種支原體）。與細菌和真核DNA無交叉反應。
3. 高靈敏度，檢測限可達到≤10CFU/ml。
4. 有相應配套的支原體基因組DNA和細菌基因組DNA，便于特異性驗證。
5.有相應配套的支原體定量標準品，便于后定量檢測。 操作步驟
第1步：樣本處理 a.細胞培養上清
b. 生物藥或需遵循藥典的樣本 說明：①樣品基質可能會影響檢測的靈敏度。收集和篩選更高的樣品量可提高測定靈敏度。 ②細胞培養物樣本含豐富的DNA酶，在低溫下也能降解支原DNA，影響檢測靈敏度。 建議：樣本做DNA抽提處理，實現較高靈敏度。 推薦：德國MB公司生產的支原體DNA提取試劑盒 Venor® Gem Sample Preparation Kit 該DNA抽提試劑盒已經過廣泛驗證。 第2步：試劑制備 a. 凍干粉溶解
b. 反應體系制備 b1) 樣品為細胞上清篩查——反應體系制備
b2) 樣品為生物藥——反應體系制備
第3步：啟動熒光定量PCR儀
第4步：結果判別 FAM通道：檢測支原體熒光信號。HEX通道：檢測內控對照熒光信號。 支原體DNA和內控DNA存在信號的競爭性抑制。 支原體DNA越多，FAM通道信號越高，檢測內控對照的HEX通道信號越低。 定量需基于Ct值和DNA標準曲線。 Ct＜40為陽性結果。Ct≥40為陰性結果。
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