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要開發(fā)無血清培養(yǎng)基，關(guān)鍵是找出血清中支持細(xì)胞生長的所有成分。其必要性在于有些細(xì)胞非常挑剔，同時(shí)要注意不同細(xì)胞系的營養(yǎng)需求差別較大。因此，不可能設(shè)計(jì)出一種適合所有細(xì)胞系的通用培養(yǎng)基。事實(shí)上，即使是同一細(xì)胞系，其內(nèi)部的不同克隆，營養(yǎng)需求也存在差異。

無血清培養(yǎng)基存在如下幾種：化學(xué)限定培養(yǎng)基所有成分均知其化學(xué)結(jié)構(gòu)，它可包含蛋白質(zhì)。無蛋白培養(yǎng)基則不包含大分子蛋白，其成分可能并非化學(xué)限定。無動(dòng)物源培養(yǎng)基也可能不是化學(xué)限定的，它只是不包含動(dòng)物來源的成分。理想的培養(yǎng)基是化學(xué)限定的無蛋白、無動(dòng)物源成分培養(yǎng)基。但經(jīng)常發(fā)現(xiàn)，隨著成分限定性的增加，培養(yǎng)基的性能則不斷下降。

無血清培養(yǎng)基的開發(fā)有從上至下法和從下至上法。從上至下法是為類似細(xì)胞系選擇已知配方的培養(yǎng)基，添加血清，使細(xì)胞達(dá)到大生長。再逐步減少血清，使細(xì)胞生長速率降至原先的50%。這時(shí)再選擇性地加入某些成分，使細(xì)胞恢復(fù)生長至原先水平。

該方法較為簡易。屬于同一類別的細(xì)胞系經(jīng)常需要同一生長因子。因此，對(duì)一種上皮細(xì)胞系有效的配方對(duì)另一種上皮細(xì)胞系，可能只需做極小的調(diào)整。用該方法開發(fā)配方較為容易。該過程也涉及細(xì)胞的馴化，其中細(xì)胞會(huì)自身合成一些必需組分。該方法的缺點(diǎn)是可能存在很多非必需成分，有些成分還會(huì)抑制生長。

另一種方法是從下至上法。它系統(tǒng)加入可能促生長的組分，使細(xì)胞生長逐漸升高。這樣只有生長必需的成分才會(huì)留在配方內(nèi)。用該方法開發(fā)的培養(yǎng)基能使細(xì)胞具有更高的生長速率，并且更容易獲得改進(jìn)。

圖. 確定一個(gè)成分的濃度

此外，統(tǒng)計(jì)法也常用于無血清配方的開發(fā)。

目前已知取代血清的能夠促細(xì)胞分裂的成分有：蛋白水解物（動(dòng)物蛋白、植物蛋白或菌體蛋白）、胰島素和胰島素樣生長因子（IGF）、表皮生長因子、轉(zhuǎn)鐵蛋白、黏附因子等。

在蛋白水解物中，酵母、大豆、小麥、棉花、豌豆水解物已經(jīng)廣泛使用。但水解物成分較為復(fù)雜，有人用HPLC和質(zhì)譜分析大豆水解物410種成分中，253種為多肽。要實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的生長，常非單一使用水解物，而需要多種組分的搭配。同時(shí)，同一水解物批次之間存在一定的組成差異，用NMR指紋圖譜可進(jìn)行批間一致性和產(chǎn)品質(zhì)量的預(yù)測(cè)。

胰島素是5.7KD的多肽，許多細(xì)胞需要。它可刺激細(xì)胞DNA的合成。目前，有重組胰島素可添加至無動(dòng)物源培養(yǎng)基配方中。IGF與胰島素接近，但促細(xì)胞分裂活性更強(qiáng)。

總之，目前已有商品化的無血清培養(yǎng)基，可用于細(xì)胞無血清或無動(dòng)物源環(huán)境的培養(yǎng)，只是其配方大多保密。

在近新出的無血清培養(yǎng)基產(chǎn)品中，HiMedia公司開發(fā)的CELLin1TM值得關(guān)注。它是一款化學(xué)限定的無動(dòng)物源成分的病毒生產(chǎn)用培養(yǎng)基，主要適合腎細(xì)胞系如Vero細(xì)胞系、MDBK細(xì)胞系、MDCK細(xì)胞系、PK-15細(xì)胞系和人胚肺二倍體MRC-5細(xì)胞系。以MDCK細(xì)胞系為例，初始接種密度為0.3-0.5×106個(gè)細(xì)胞/ ml，培養(yǎng)48~72小時(shí)后，細(xì)胞密度可達(dá)約3.1×106個(gè)細(xì)胞/ ml，流感病毒A的滴度可達(dá)約5.0 log10TCID50。細(xì)胞可穩(wěn)定傳代，密度可保持在3.0~3.4×106個(gè)細(xì)胞/ ml，保證種子細(xì)胞的制備。