細(xì)胞系懸液標(biāo)本制備實(shí)驗(yàn)步驟

(1)取材：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞于離心管中，800～1000r／min離心10min，棄上清，彈指法混勻細(xì)胞。沿管壁加入2．0％～2．5％冷戊二醛，輕輕吹打，4℃固定30min。用小鋁片將細(xì)清。4℃PBS緩沖液沖洗1～2h或過(guò)夜，1000r／min離心5min，棄上清。

(2)制備預(yù)包埋塊：管內(nèi)加入2％～4％37℃瓊脂糖液0．1～0．5ml，兩手搓離心管，使細(xì)胞系與瓊脂糖混勻，室溫冷卻，形成細(xì)胞瓊脂凝膠預(yù)包埋塊。離心管內(nèi)加適量PBs緩沖液或75％乙醇溶液，鋁片沿管輕輕地將細(xì)胞瓊脂糖凝膠塊松動(dòng)，預(yù)包埋塊移入含75％乙醇溶液的青霉素瓶?jī)?nèi)，24h后換固定液一次，4℃保存，1年內(nèi)使用。

(3)固定：預(yù)包埋塊切成1mm3大小，置1％鋨酸4℃固定1～2h。

(4)漂洗與脫水：PBS緩沖液反復(fù)漂洗30min或過(guò)夜。分別用50％、70％、90％、100％丙酮脫水各1次，每次10～15min；100％丙酮脫水3次，每次30min。

(5)浸透、包埋與聚合：浸入稀釋包埋劑(丙酮：包埋劑為1：1)中，室溫1h。再浸入純包埋劑(如環(huán)氧樹脂)中，37℃過(guò)夜。60℃固化48h。干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

(6)超薄切片：首先將標(biāo)本包埋塊頂端修成近45。的四邊錐體，使標(biāo)本暴露出來(lái)，切面呈長(zhǎng)寬約為0．4mm～0. 6mm的長(zhǎng)方形或梯形。然后將其夾在標(biāo)本夾中，固定在切片機(jī)上。玻璃切片刀需用膠布圍成水槽，加入適量蒸餾水，使切下的薄片漂在水面，用覆有支持膜(透明塑膠膜)的載網(wǎng)(銅網(wǎng)或鎳網(wǎng))收集。可以根據(jù)薄片與水面反射光所產(chǎn)生的干涉色判斷切片的厚度：以銀白色(50～70nm)為*；薄片大于l00nm(紫紅色)，電子束的穿透較差，微細(xì)結(jié)構(gòu)辨別不清；但小于40nm(暗灰色)圖像反差低，難以觀察。

(7)染色：在平皿中放一片蠟紙，并在其上滴1滴乙酸鈾染液，用彎頭小鑷子夾住載網(wǎng)邊緣，把貼有薄片的一面朝下，輕輕插入染液中，蓋上平皿蓋，室溫下染色10～20min，雙蒸水清洗2次；置人枸櫞酸鉛染液中染色15min，0. 1mol/L NaOH染液漂洗1～2s，雙蒸水清洗2次。

(8)觀察：切片自然干燥后觀察。

細(xì)胞系注意事項(xiàng)

(1)鋨酸揮發(fā)性強(qiáng)，有強(qiáng)烈的刺激性氣味且毒性強(qiáng)，易蒸發(fā)，對(duì)皮膚、呼吸道黏膜及眼睛角膜有傷害作用，因此操作時(shí)應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。配制和儲(chǔ)存不當(dāng)會(huì)產(chǎn)生鋨黑，使其失效，因此需冷凍、密封和避光保存，臨用前需*化開，以免濃度欠佳。

(2)玻璃切片刀現(xiàn)用現(xiàn)做，通常一把刀切一個(gè)標(biāo)本。

(3)乙酸鈾染液有微量放射性，能發(fā)熒光，需小心使用、避光保存。染色時(shí)應(yīng)避免強(qiáng)光直射，避免污染皮膚和實(shí)驗(yàn)臺(tái)面。

(4)染色時(shí)要注意染液的濃度、pH和染色時(shí)間等必要條件，使染色的同時(shí)不會(huì)掩蓋精細(xì)結(jié)構(gòu)的層次。