原代細(xì)胞對(duì)于細(xì)胞轉(zhuǎn)染而言，目前主要是轉(zhuǎn)染試劑(多為脂質(zhì)體)的天下。磷酸鈣轉(zhuǎn)染的方法雖說有些out，但有些細(xì)胞還就認(rèn)準(zhǔn)這一套。不過，對(duì)于某些淋巴細(xì)胞而言，化學(xué)方法怎么都不奏效，那我們只能采取強(qiáng)硬手段，用電穿孔的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

應(yīng)用電穿孔時(shí)，一般都選擇恒定的電容，然后在不同的場(chǎng)強(qiáng)下轟擊細(xì)胞，以摸索*實(shí)驗(yàn)條件。就大多數(shù)細(xì)胞而言，在電穿孔后能有20-50%的細(xì)胞存活率就OK，足以保證DNA的成功轉(zhuǎn)染。電穿孔通常在室溫下進(jìn)行，之后將細(xì)胞置于冰上，以延長(zhǎng)原代細(xì)胞膜孔道開放的時(shí)間。

與傳統(tǒng)的磷酸鈣和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染相比，電穿孔具有操作簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)染效率高等諸多優(yōu)點(diǎn)。但它也受多種因素的影響。電壓太低時(shí)，細(xì)胞膜的改變不足以允許DNA分子通過，而電壓過高時(shí)又會(huì)造成細(xì)胞的損傷。這也就是常說的對(duì)細(xì)胞毒性大。因此轉(zhuǎn)染時(shí)所需的細(xì)胞要比其他方法更多。同時(shí)，轉(zhuǎn)染時(shí)所需的DNA也更多。如果想要穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的話，將DNA線性化后可能效果更好，因?yàn)榫€性DNA更容易整合到基因組DNA上。其他條件如緩沖液、轉(zhuǎn)染溫度等也會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)染效果產(chǎn)生影響。

由于貼壁細(xì)胞必須附著在培養(yǎng)瓶的表面才能生長(zhǎng)，因此懸浮細(xì)胞更易通過電穿孔方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。不過，不同細(xì)胞間的*轉(zhuǎn)染參數(shù)變異較大，需要不斷摸索。如果有優(yōu)化好的轉(zhuǎn)染步驟用來參考，那就不過了。

Bio-Rad公司zui近就新發(fā)布了12種原代細(xì)胞和細(xì)胞系的電穿孔步驟，幫你節(jié)省了優(yōu)化的時(shí)間。這些細(xì)胞包括T細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和幾種B細(xì)胞淋巴瘤。除了這12種細(xì)胞，數(shù)據(jù)庫中還包括了很多常用細(xì)胞系如293、3T3、CHO的電穿孔步驟。這些步驟包括了優(yōu)化過的電壓、電容、細(xì)胞密度、電轉(zhuǎn)緩沖液等，是在Bio-Rad 公司Gene Pulser Mxcell電穿孔系統(tǒng)和Gene Pulser緩沖液的基礎(chǔ)上進(jìn)行開發(fā)的。