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轉化細胞大規模培養技術的操作方式

時間:2017/7/13閱讀:1043
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轉化細胞深層培養可分為:分批式、流加式、半連續式、連續式、連續式和灌注式五種。

一、分批式培養(batch culture)  是細胞規模培養發展進程中較早期采用的方式,也是其它操作方式的基礎。該方式采用機械攪拌式生物反應器,將細胞擴大培養后,一次性轉入生物反應器內進行培 養,在培養過程中其體積不變,不添加其它成分,待細胞增長和產物形成積累到適當的時間,一次性收獲細胞、產物、培養基的操作方式。

該方式的特點:

操作簡單。培養周期短,染菌和細胞突變的風險小。反應器系統屬于封閉式,培養過程中與外部環境沒有物料交換,除了控制溫度、pH值和通氣外,不進行其他任何控制,因此操作簡單,容易掌握;

直觀反映細胞生長代謝的過程。因培養期間細胞生長代謝是在一個相對固定的營養環境,不添加任何營養成分,因此可直觀的反映細胞生長代謝的過程,是動物細胞工藝基礎條件或"小試"研究常用的手段;

可直接放大。由于培養過程工藝簡單,對設備和控制的要求較低,設備的通用性強,反應器參數的放大原理和過程控制,比較其它培養系統較易理解和掌握,在工業化中分批式培養操作是傳統的、常用的方法,其工業反應器(Genetech)規??蛇_12000L。

分批培養過程中,細胞的生長分為五個階段:延滯期、對數生長期、減速期、平穩期和衰退期,見圖1。分批培養的周期時間多在3-5天,細胞生長動力學 表現為細胞先經歷對數生長期(48-72h)細胞密度達到zui高值后,由于營養物質耗劫或代謝毒副產物的累積細胞生長進入衰退期進而死亡,表現出典型的生長 周期。收獲產物通常是在細胞快要死亡前或已經死亡后進行。

二、流加式培養(feeding culture)

1、流加式培養是在批式培養的基礎上,采用機械攪拌式生物反應器系統,懸浮培養細胞或以懸浮微載體培養貼壁細胞,細胞初始接種的培養基體積一般為終 體積的1/2~1/3,在培養過程中根據細胞對營養物質的不斷消耗和需求,流加濃縮的營養物或培養基,從而使細胞持續生長至較高的密度,目標產品達到較高 的水平,整個培養過程沒有流出或回收,通常在細胞進入衰亡期或衰亡期后進行終止回收整個反應體系,分離細胞和細胞碎片,濃縮、純化目標蛋白。

2、流加培養特點:

流加培養細胞生長速率、營養物消耗和代謝產物抑制情況,流加濃縮的營養培養基。流加的速率與消耗的速率相同,按底物濃度控制相應的流加過程,保證合理的培養環境與較低的代謝產物抑制水平。

培養過程以低稀釋率流加,細胞在培養系統中停留時間較長,總細胞密度較高,產物濃度較高。

流加培養過程須掌握細胞生長動力學,能量代謝動力學,研究細胞環境變化時的瞬間行為。流加培養細胞培養基的設計和培養條件與環境優化,是整個培養工藝中的主要內容。

在工業化,懸浮流加培養工藝參數的放大原理和過程控制,比較其它培養系統較易理解和掌握,可采用工藝參數的直接放大。

流加培養是當前動物細胞培養中占有主流優勢的培養工藝,也是近年來動物細胞大規模培養研究的熱點。流加培養中的關鍵技術是基礎培養基和流加濃縮的營 養培養基。通常進行流加的時間多在指數生長后期,細胞在進入衰退期之前,添加高濃度的營養物質??梢蕴砑右淮危部商砑佣啻危瑸榱俗非蟾叩募毎芏韧?需要添加一次以上,直至轉化細胞密度不再提高;可進行脈沖式添加,也可以降低的速率緩慢進行添加,但為了盡可能的維持相對穩定的營養物質環境,后者采用較多; 添加的成分比較多,凡是促細胞生長的物質均可以進行添加。流加的總體原則是維持細胞生長相對穩定的培養環境,營養成分即不過剩而產生大量的代謝副產物造成 營養利用效率下降而成為無效的利用;也不缺乏導致細胞生長抑制或死亡。

3、流加工藝中的營養成分主要分為三大類:

葡萄糖:葡萄糖是細胞的供能物質和主要的碳源物質,然而當其濃度較高是會產生大量的代謝產物乳酸,因而需要進行其濃度控制,以足夠維持細胞生長而不至于產生大量的副產物的濃度為佳。

谷氨酰胺:谷氨酰胺是細胞的供能物質和主要的氮源物質,然而當其濃度較高是會產生大量的代謝產物氨,因而也需要進行其濃度控制,以足夠維持細胞生長而不至于產生大量的副產物的濃度為佳;

大規模培養中細胞凋亡主要由于營養物質的耗竭或代謝產物的堆積引起,如谷氨酰胺的耗竭是zui常見的凋亡原因,而且凋亡一旦發生,補加谷氨酰胺已不能逆轉凋亡。另外,動物細胞在無血清、無蛋白培養基中進行培養時,細胞變得更為脆弱,更容易發生凋亡。

氨基酸、維生素及其他:主要包括營養必需氨基酸、營養非必需氨基酸、一些特殊的氨基酸如羥脯氨酸、羧基谷氨酸和磷酸絲氨酸;此外還包括其他營養成分 如膽堿。添加的氨基酸形式多為左旋氨基酸,因而多以鹽或前體的形式替代單分子氨基酸,或者添加四肽或短肽的形式。在進行添加時,不溶性氨基 酸如胱氨酸、酪氨酸和色氨酸只在中性pH值部分溶解,可采用泥漿的形式進行脈沖式添加;其他的可溶性氨基酸以溶液的形式用蠕動泵進行緩慢連續流加。

4、流加式培養分為兩種類型:單一補料分批式培養和反復補料分批式培養。

單一補料分批式培養是在培養開始時投入一定量的基礎培養液,培養到一定時期,開始連續補加濃縮營養物質,直到培養液體積達到生物反應器的zui大操作容積,停止補加,zui后將細胞培養液一次全部放出。該操作方式受到反應器操作容積的限制,培養周期只能控制在較短的時間內。

反復補料分批式培養是在單一補料分批式操作的基礎上,每個一定時間按一定比例放出一部分培養液,是培養液體積始終不超過反應器的zui大操作容積,從而在理論上可以延長培養周期,直至培養效率下降,才將培養液全部放出。

三、半連續式培養(semi-continuous culture)

1、半連續式培養又稱為重復分批式培養或換液培養。采用機械攪拌式生物反應器系統,懸浮培養形式。在細胞增長和產物形成過程中,每間隔一段時間,從中取出部分培養物,再用新的培養液補足到原有體積,使反應器內的總體積不變。

這種類型的操作是將細胞接種一定體積的培養基,讓其生長至一定的密度,在細胞生長至zui大密度之前,用新鮮的培養基稀釋培養物,每次稀釋反應器培養體 積的1/2~3/4,以維持細胞的指數生長狀態,隨著稀釋率的增加培養體積逐步增加?;蛘咴诩毎鲩L和產物形成過程中,每隔一定時間,定期取出部分培養 物,或是條件培養基,或是連同細胞、載體一起取出,然后補加細胞或載體,或是新鮮的培養基繼續進行培養的一種操作模式。剩余的培養物可作為種子,繼續培 養,從而可維持反復培養,而無需反應器的清洗、消毒等一系列復雜的操作。在半連續式操作中由于細胞適應了生物反應器的培養環境和相當高的接種量,經過幾次 的稀釋、換液培養過程,轉化細胞密度常常會提高。

2、半連續式特點:

培養物的體積逐步增加;

可進行多次收獲;

細胞可持續指數生長,并可保持產物和細胞在一較高的濃度水平,培養過程可延續到很長時間。

該操作方式的優點是操作簡便,效率高,可長時期進行,反復收獲產品,可使細胞密度和產品產量一直保持在較高的水平。在動物細胞培養和藥品中被廣泛應用。

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