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貼壁細胞的傳代培養實驗操作方法
實驗原理
細胞在培養瓶長成致密單層后,已基本飽和,為使干細胞能繼續生長,同時也將細胞數量擴大,就必須進行傳代(再培養)。傳代培養是一種將細胞種保存下去的方法,同時也是利用培養細胞進行各種實驗的必經過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以,而貼壁細胞需經消化后才能分瓶。
實驗材料
CO2培養箱、倒置顯微鏡、超凈工作臺、培養瓶、試管、移液管、巴斯德吸管、廢液缸、75%秀精棉球、酒精燈、貼壁細胞株、*培養基(RPMLI640或DMEM)、0.25%胰蛋白酶、PBS液。
操作步驟
(1)傳代前準備
A.預熱培養用液:把已經配制好的培養液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內預熱。
B.消毒:用75%酒精棉球擦拭經過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。
C.正確擺放使用的器械:保證足夠的操作空間,不僅便于操作而且可減少污染。
D.點燃酒精燈:注意火焰不能太小。
E.超凈工作臺內拆除已消毒空培養瓶的外包裝。
F.取出預熱好的培養用液:取出已經預熱好的培養用液,用酒精棉球擦拭好后放入超凈工作臺內。
G.從培養箱內取出細胞:注意取出干細胞時要旋緊瓶蓋,用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面,再在顯微鏡下觀察細胞。
H.打開瓶口:將各瓶口一一打開,同時要在酒精燈上燒口消毒。
(2)胰蛋白酶消化
A.入消化液:小心吸出舊培養液,用PBs清洗(沖洗),加入適量消化液(胰蛋白酶液),注意消化液的量以蓋住細胞,*消化溫度是37℃。
B.顯微鏡下觀察細胞:倒置顯微鏡下觀察消化細胞,若胞質回縮,細胞之間不再連接成片,表明此時細胞消化適度。
C.終止消化:加入與消化液等體積的新鮮培養液。
(3)吹打分散細胞
A.打制懸:用滴管將已經消化細胞吹打成細胞懸液。
B.吸細胞懸液人離心管:將細胞懸液吸人10 mL離心管中。
C.平衡離心:平衡后將離心管放入臺式離心機中,以1000r/min離心5 min。
D.棄上清液,加入新培養液:棄去上清液,加入2mL培養液,用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。
(4)分裝稀釋細胞
A.裝:將細胞懸液吸出分裝至2—3個培養瓶中,加入適量培養基旋緊瓶蓋。
B.顯微鏡下觀察細胞:倒置顯微鏡下觀察細胞量,必要時計數。注意密度過小會影響傳代細胞的生長,傳代細胞的密度應該不低于5×105個/mL。做好標記。
(5)繼續培養
用酒精棉球擦拭培養瓶,適當旋松瓶蓋,放人CO2培養箱中繼續培養。傳代細胞2h后開始貼附在瓶壁上。
注意事項
A.嚴格的無菌操作。
B.適度消化:消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養瓶中的量等諸多因素的影響,消化過程中應該注意培養干細胞形態的變化,一旦胞質回縮,連接變松散,或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。
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