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谷丙轉氨酶(ALT/GPT)測試盒的注意點

時間:2023/12/4閱讀:626
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谷丙轉氨酶(ALT/GPT)測試盒的注意點

 微板法)

一、測定原理:

谷丙轉氨酶(ALT)在 37℃及 PH7.4 條件下,作用于丙

氨酸及α-酮戊二酸組成的底物,生成丙酮酸及谷氨酸。反應

30min 后(固定時間)加入 2,4-二-硝-基-苯肼(DNPH)鹽酸溶

液,既中止反應,同時 DNPH 與酮酸中羰基加成,生成丙酮

酸苯腙。苯腙在堿性條件下呈紅棕色,于 505nm 比讀吸光度

并計算酶活力。

二、試劑的組成與配制:(96T)

試劑一:谷丙轉氨酶基質液,5mL×1 瓶,4℃冰箱保存 6 個月;

試劑二:2,4—二-硝-基-苯肼液,5mL×1 瓶,4℃冰箱保存 6 個月;

試劑三:4mol/L 氫氧化鈉液,5mL×1 瓶,室溫密封保存 6 個月;

0.4mol/L 氫氧化鈉液的配制,臨用時按 4mol/L 氫氧化鈉液:

蒸水=19 的比例稀釋,需多少配多少,室溫密封保存。

試劑四:2mmol/mL 丙酮酸鈉標準液×1 支,4℃冰箱保存 6 個月;

試劑五:0.1mol/L 磷酸鹽緩沖液×1 支,4℃冰箱保存 6 個月。

三、操作過程:

1、樣本前處理:

①、血清(漿)及其它液體樣本待測:直接測定。

②、動物組織樣本:準確稱取組織重量,按重量(g):體積

(mL)=1:9 的比例,加入 9 倍體積的生理鹽水,冰水浴條件

下機械勻漿,2500 /分,離心 10 分鐘,取上清液待測。

③、培養細胞樣本前處理:將收集好的細胞用等滲緩沖液(推

0.1mol/L pH77.4 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水)清洗 1

2 次;1000 /,離心 10 分鐘,棄上清,留細胞沉淀,加入勻

漿介質(推薦加入 0.1mol/L pH77.4 磷酸鹽緩沖液或生

理鹽水),冰水浴條件下超聲破碎或手動勻漿,制備好的

勻漿液不離心,待測。

2、操作表:

1比色法中常用的有賴氏(Reitman-Frankel)法及金氏(King

法。賴氏法標準曲線所定單位數,是用實驗方法和卡門氏分

光度法(速率法)作對比測定求得的。以卡門氏單位報

告結果,比較準確。

卡門氏單位定義1mL 液體,反應液總容量 3mL,波長 340nm

1cm 光徑,25℃,1min 內所生成的丙酮酸,使 NADH 氧化

NAD+而引起吸光度每下降 0.001 為一個單位(1 卡門氏

單位=0.482 U/L25℃)。

2一般血清標本內源性酮酸很少,血清對照孔吸光度值接近試

劑空白孔(以雙蒸水代替血清,其他和對照孔同樣操作)。

所以,成批標本測定時,一般不需要每一標本都作本身血清

對照孔,以試劑空白孔代替即可,但對脂血、黃疸或溶血血

清,每份標本應作對照孔。

3酶活力超過 150 卡門氏單位時,用生理鹽水稀釋血清后重測。

4應將一般血清的對照孔(或稱標本空白孔)的吸光度作為日

常質控的指標之一;如相差大,可考慮α-酮戊二酸濃度、DNPH

濃度及儀器等原因引起。

5血清中 ALT 在室溫(25℃)可保存 2 天,在 04℃可保存一

周,在-25℃可保存 1 個月。

附錄Ⅰ:ALT 標準曲線

1、操作表:

附錄Ⅱ:組織中 ALT 測定

1、樣本前處理:

準確稱取組織重量,按重量(g):體積(mL)=1:9 的比例,加入 9 倍體

積的生理鹽水,冰水浴條件下機械勻漿,制成 10%的組織勻漿,2500

/,離心10分鐘,取上清液,再用生理鹽水稀釋到適宜濃度(通過標

準曲線后計算得勻漿液卡門氏單位值小于 150)待測。(取部分上清

液測蛋白濃度,蛋白定量試劑盒本所有售)

2、操作表:

組織中 活力= 通過標準曲線得 ?待測勻漿液蛋白

勻漿液ALT活力 濃度

附錄Ⅲ:血清(漿)中 ALT 測定

1、前處理:

血清(漿)直接取樣進行測定。(若酶活力超過 150 卡門氏單位

時,需用生理鹽水稀釋血清后重新測定)

2、操作表:

谷丙轉氨酶(ALT/GPT)測試盒的注意點



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