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細胞凋亡過程常伴隨著明顯的細胞形態學變化，比如細胞凋亡早期，質膜內側的磷脂酰絲氨酸會翻轉到細胞質膜表面；而在凋亡的中后期，隨著細胞質膜通透性的增大，一些較大分子的化合物，如碘化丙啶(PI)，便可自由擴散進入細胞，將細胞核染上紅色熒光。

Annexin VPI檢測法原理

Annexin V是一種鈣依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合。它不能透過完整的細胞膜，而早期凋亡細胞的細胞膜是完好的，對PI有拒染性。但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能透過細胞膜而使細胞核染上。因此Annexin V 和PI同時使用，可以將凋亡早期的細胞與其它細胞區別開來。

Annexin VPI凋亡檢測推薦（李記生物）

[名稱]  流式凋亡檢測試劑盒

[貨號]  AC12L033

[規格]  100T

Annexin VPI檢測法操作步驟

? 對照管的設置

   1、空白管：誘導凋亡的細胞不加染料，用來調節電壓；

   2、單染管：分別需要只加PI和熒光標記的Annexin V兩個單染管，用來調節補償；

   3、實驗管：誘導凋亡的細胞加本次實驗的所有熒光染料；

   4、陰性管：正常培養細胞加入染料，確認細胞正常狀態，排除假陽性。

? 懸浮細胞收集染色

   1、在進行完細胞凋亡刺激后，離心5分鐘，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數。

   2、取1~5×10^5重懸的細胞，離心5分鐘，棄上清，加入500µl 結合液輕輕重懸細胞。

   3、加入5µl Annexin V-FITC，輕輕混勻；再加入5 μL 碘化丙啶，輕輕混勻。

   4、室溫避光孵育10分鐘。可以使用鋁箔進行避光。

   5、隨即進行流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

? 貼壁細胞收集染色

   1、把細胞培養液吸出至一合適離心管內，PBS洗滌貼壁細胞一次，用胰酶細胞消化液(最好不用含有EDTA)消化細胞。

   2、細胞消化下來后，同理懸浮細胞的操作步驟。

? 上機檢測

      染色孵育后，立即進行流式細胞儀檢測或熒光顯微鏡檢測。

Annexin VPI流式結果圖（僅做參考）

圖：流式細胞儀凋亡檢測結果圖

 ? 左上象限(Annexin V-/PI+)：為細胞碎片、機械損傷細胞或其它死細胞；Annexin V-/PI+象限中細胞數越多，實驗結果可信度就越低，因盡量控制本象限細胞比例。

 ? 左下象限(Annexin V-/PI-)：為正常的活細胞；

 ? 右上象限(Annexin V+/PI+)：為晚期凋亡細胞或壞死細胞，細胞膜損傷的細胞DNA可被PI著染產生紅色熒光；

 ? 右下象限(Annexin V+/PI-)：為早期凋亡細胞，在細胞凋亡的早期PI無法著染，不會產生紅色熒光信號。

Annexin VPI檢測法注意事項

 • 檢測貼壁細胞時，若不好控制消化時間，建議用Accutase細胞消化液，對細胞損傷小且不會改變細胞膜上PS的分布。

 • 選擇Annexin-V的熒光染料時要考慮細胞的自發熒光，特別是培養時間久或藥物處理的細胞，一定注意細胞代謝物藥物本身的熒光，一般來說細胞代謝物的自發熒光會干擾FITC/PE，所以可建議用Annexin-V APC，藥物的干擾可查看藥物本身的發射光譜是否會對檢測選擇的染料有影響。

 • 細胞染色完成后，禁止固定，盡快檢測完，可將檢測管放冰上，可減少外界環境對檢測結果的影響。

 • 在做凋亡統計時一般指統計前凋亡，因為只有前凋亡才有意義，當然也有文獻統計總的凋亡比例（前凋亡和晚期凋亡之和），單純的統計晚期凋亡比例意義不大。