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蛋白質(zhì)印跡(Western Blot) 保姆級教程 Part1:實(shí)驗(yàn)方案

時間:2024/8/9閱讀:483
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蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)保姆級教程

Part1:實(shí)驗(yàn)方案

 

蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的特點(diǎn),采用聚丙烯酰胺凝膠電泳,經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品,轉(zhuǎn)移到固相載體,以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng),再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng),經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白。

 

我們的Western Blot實(shí)驗(yàn)方案包含蛋白提取、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育抗體、檢測(圖1)及所涉及的試劑,為您的WB實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航。


蛋白質(zhì)印跡(Western Blot) 保姆級教程  Part1:實(shí)驗(yàn)方案

圖1、Western Blot實(shí)驗(yàn)步驟


● 蛋白提取

1、使用Trident Extraction Kits從樣本(細(xì)胞或組織)中提取蛋白。

(注:根據(jù)蛋白與抗體的具體情況優(yōu)化細(xì)胞數(shù)量以及上樣量)

2、蛋白濃度定量,在-20℃或更低溫度下冷凍保存。

3、在樣品中加入Trident Sample Buffer,100℃煮沸5mins,使蛋白質(zhì)變性;瞬時離心上樣。

(注:必要時,使用前在Trident Sample Buffer加入二硫蘇糖醇(DTT)或/3-巰基乙醇(2-ME))

 

● 相關(guān)產(chǎn)品

貨號

名稱

規(guī)格

GTX400005

Trident RIPA Lysis Buffer

100ml

GTX400033

Trident RIPA Lysis Buffer (Low SOS)

250ml

GTX00835

Trident High-Efficiency Exosome Precipitation Reagent

20ml

GTX16357

Trident 6x Laemmli SOS Sample Buffer

25ml

 

● SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜

1、將30 µg蛋白或 100 ng純化蛋白裝入SDS-PAGE凝膠孔中。

在SDS-PAGE凝膠孔中加入適量的Trident Blue Prestained Protein Ladder (GTX16376) 或 Trident Prestained Protein Ladder(高范圍:GTX50875 或標(biāo)準(zhǔn)范圍:GTX49384)裝入1個或多個額外的泳道中。

2、使用1x Running buffer以50-100 V的電壓運(yùn)行1-2小時。建議將電壓調(diào)低并延長時間。可使條帶更清晰,分辨率更高。

3、在Transfer buffer中將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或甲醇漂洗過的PVDF膜上。

(可選:在進(jìn)行下一步之前,通過 Ponceau Red染色確認(rèn)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移成功)

 

● 相關(guān)產(chǎn)品

貨號

名稱

規(guī)格

GTX16370

Trident 20% SOS (w/v)

500ml

GTX50875

Trident Prestained Protein Ladder (High Range)

500µI

GTX49384

Trident Prestained Protein Ladder (Standard Range)

500µI

GTX16376

Trident Blue Prestained Protein Ladder

500µI

 

蛋白質(zhì)印跡(Western Blot) 保姆級教程  Part1:實(shí)驗(yàn)方案

 

● 封閉、孵育抗體、洗膜

1. 封閉:在3%脫脂牛奶/PBST或Trident Universal Protein Blocking Reagent(GTX30963)中封閉30-60分鐘。

2. 一抗孵育:將膜置于含適當(dāng)稀釋一抗的1%脫脂牛奶/PBST或Trident Universal Protein Blocking Reagent(GTX30963)中,在RT下孵育兩小時或在4°C下過夜。

3. 洗膜:1x PBST ,一次10分鐘,兩次5分鐘。

4. 二抗孵育:將膜置于含適當(dāng)稀釋二抗的1%脫脂奶/PBST 或Trident Universal Protein Blocking Reagent(GTX30963)中孵育1小時。

5. 洗膜:1x PBST ,三次,每次10分鐘。

(注:Trident Universal Protein Blocking Reagent不含任何動物血清,適用于WB、ELISA、IHC和ICC/IF實(shí)驗(yàn))

 

● 相關(guān)產(chǎn)品


貨號

名稱

規(guī)格

GTX30963

Trident Universal Protein Blocking Reagent (animal serum-free)

100ml

GTX30977

Trident 10x PBST

100ml

GTX30976

Trident 10x TBST

100ml

GTX213110-01

Goat Anti-Rabbit lgG antibody (HRP)

1ml

GTX213111-01

Goat Anti-Mouse lgG antibody (HRP)

1ml

GTX224125-01

Rabbit Anti-Rat lgG antibody (HRP)

1ml

GTX224126-01

Rabbit Anti-Chicken lgY antibody (HRP)

1ml

GTX232040-01

Donkey Anti-Goat lgG antibody (HRP)

1ml

GTX221666-01

EasyBlot anti Rabbit lgG (HRP)

250µI , 50µI

GTX221667-01

EasyBlot anti Mouse lgG (HRP)

250µI , 50µI

GTX628474-01

EasyBlot anti Rat lgG (HRP)

250µI , 50µI

GTX628547-01

EasyBlot anti Goat lgG (HRP)

250µI , 50µI

GTX628906-01

EasyBlot anti Sheep lgG (HRP)

250µI , 50µI



 蛋白質(zhì)印跡(Western Blot) 保姆級教程  Part1:實(shí)驗(yàn)方案 

 

● 基于ECL成像

按照Trident plus Western HRP Substrate(GTX400006)或Trident femto Western HRP Substrate(GTX14698)來檢測信號。


貨號

名稱

規(guī)格

GTX400006

Trident plus Western HRP Substrate

500ml

GTX17435

Trident pico Western HRP Substrate

100/500ml

GTX14698

Trident femto Western HRP Substrate

100/200ml

蛋白質(zhì)印跡(Western Blot) 保姆級教程  Part1:實(shí)驗(yàn)方案





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